復(fù)方天龍咳喘靈中有效成分的分析及其含量測定.pdf

1、研究背景與目的:
　　天龍咳喘靈是根據(jù)我院廣東省名中醫(yī)邱志楠教授臨床驗方研制的中藥復(fù)方制劑,由青天葵、法半夏、款冬花、熟附子、魚腥草、五味子等多味藥材組成,具有抗感染、化痰止咳平喘、提高機體免疫力的功效。我院中醫(yī)臨床用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性哮喘,以及喘息性支氣管炎等展示明顯的療效,但其發(fā)揮作用的現(xiàn)代藥理學(xué)機制和物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天龍咳喘靈具有顯著抗哮喘動物模型氣道高反應(yīng)與防治氣道重構(gòu)作用,與該

2、復(fù)方含有豐富的黃酮類化合物有關(guān)。對天龍咳喘靈中黃酮類成分進行募集純化,測得其總黃酮的含量為28.03％。
　　中藥復(fù)方制劑是由多味中藥合理搭配,通過多靶點、多途徑的協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮其治療作用的。單一的有效化學(xué)成分并不能闡釋中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的物質(zhì)機理,中藥復(fù)方的藥效來自于多種化學(xué)成分多靶點的相互協(xié)同和調(diào)節(jié)作用。中藥復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是各類有效成分保持適宜的濃度范圍和比例,通過煎煮等制備形成一個整體進而發(fā)揮作用。因此,本實驗在原有工作的基

3、礎(chǔ)上進一步系統(tǒng)鑒定分析天龍咳喘靈的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為用現(xiàn)代分子藥理學(xué)理論揭示該復(fù)方抗哮喘等治療的機制奠定物質(zhì)基礎(chǔ),并為其二次開發(fā)利用提供依據(jù)。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　第一部分:天龍咳喘靈中槲皮素的含量測定
　　1.建立適合的槲皮素的含量測定方法。
　　2.通過單因素試驗和正交試驗來考察水解溫度、水解時間和鹽酸濃度這三個因素對天龍咳喘靈中槲皮素含量測定的影響,篩選出天龍咳喘靈的最佳水解條件。
　　第二部分:

4、天龍咳喘靈中三萜類化合物及其甘草酸的含量測定
　　1.應(yīng)用紫外-可見分光光度法測定天龍咳喘靈中三萜類化合物的含量。
　　2.應(yīng)用高效液相色譜法測定天龍咳喘靈中甘草酸的含量。
　　第三部分:天龍咳喘靈中總酚酸和阿魏酸的含量測定
　　1.應(yīng)用紫外-可見分光光度計,采用兩種不同的處理方法測定天龍咳喘靈中總酚酸的含量。
　　2.應(yīng)用高效液相色譜法測定天龍咳喘靈中阿魏酸的含量。
　　第四部分:天龍咳喘靈中木脂素

5、的含量測定
　　應(yīng)用紫外-可見分光光度計,建立適合的天龍咳喘靈中木脂素的含量測定方法。
　　結(jié)果:
　　第一部分:天龍咳喘靈中槲皮素的含量測定
　　1.采用高效液相色譜法測定天龍咳喘靈中槲皮素的含量時,選擇C18色譜柱,流動相為無水甲醇-濃度0.4%磷酸溶液(45-55,V/V),其在0.0168～0.0840mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為99.83%,RSD為2.03%,測得槲皮

6、素的含量為13.0mg/g。
　　2.通過單因素試驗和正交試驗結(jié)果可知,水解溫度、水解時間、鹽酸濃度這3個因素對槲皮素含量測定的影響主次順序依次為水解時間>水解溫度>鹽酸濃度。由方差分析表可知水解時間的影響時顯著的,而水解溫度和鹽酸濃度的影響是相對不顯著的。由正交試驗得出的最佳水解條件為15%鹽酸(w/w),85℃水解90min。
　　第二部分:天龍咳喘靈中三萜類化合物及其甘草酸的含量測定
　　1.采用紫外-可見分光光

7、度法測定天龍咳喘靈中三萜類化合物的含量時,選擇香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法,測定波長為589nm,其在0.084～0.504mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為98.91%,RSD為1.83%,測得三萜類物質(zhì)含量為14.3mg/g。
　　2.采用高效液相色譜法測定天龍咳喘靈中甘草酸的含量時,選擇C18色譜柱,流動相為甲醇-0.2mol/L醋酸銨-冰醋酸(64:35:1),檢測波長為250nm,流速1.0ml/m

8、in,其在0.1～0.6μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998),平均回收率為99.28%,RSD為1.58%,測得甘草酸的含量為0.0544mg/g。
　　第三部分:天龍咳喘靈中總酚酸及其阿魏酸的含量測定
　　1.采用紫外-可見分光光度法測定天龍咳喘靈中總酚酸的含量時,選擇十二烷基硫酸鈉-鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法,測定波長為783nm,其在0.066～0.231mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為98

9、.88%,RSD為1.34%,測得總酚酸含量為0.6227mg/mg;未顯色法測定天龍咳喘靈中總酚酸的含量時,測定波長為320nm,其在0.012～0.072mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1),平均回收率為98.01%,RSD為1.52%,測得總酚酸含量為89.7mg/g。
　　2.采用高效液相色譜法測定天龍咳喘靈中阿魏酸的含量時,選擇C18色譜柱,流動相為甲醇-1%冰醋酸(30:70),檢測波長為320nm,流速1.0ml/min

10、,其在0.0252～0.504μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為99.39%,RSD為1.40%,測得阿魏酸含量為0.0091mg/g。
　　第四部分:天龍咳喘靈中木脂素的含量測定
　　采用紫外-可見分光光度法測定天龍咳喘靈中木脂素的含量時,選擇變色酸-濃硫酸顯色法,測定波長為570nm,其在0.005~0.030mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為100.18%,RSD為1.

11、21%,測得木脂素的含量為2.27mg/g。
　　結(jié)論:
　　1.以中醫(yī)藥理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)哮喘治療藥物藥理學(xué)理論為導(dǎo)向,建立了應(yīng)用紫外-可見分光光度法結(jié)合高效液相色譜法定量分析復(fù)方天龍咳喘靈有效部位群及主要代表性有效組分的方法。
　　2.初步鑒定出復(fù)方天龍有效部位及代表性有效組分主要包括:總黃酮(槲皮素)、三萜類(甘草酸)、總酚酸(阿魏酸、綠原酸等)以及木脂素等,并進行了量化分析。
　　3.研究從復(fù)方天龍咳喘靈的