復(fù)方天龍咳喘靈中有效成分的分析及其含量測(cè)定.pdf

1、研究背景與目的:
　　天龍咳喘靈是根據(jù)我院廣東省名中醫(yī)邱志楠教授臨床驗(yàn)方研制的中藥復(fù)方制劑,由青天葵、法半夏、款冬花、熟附子、魚(yú)腥草、五味子等多味藥材組成,具有抗感染、化痰止咳平喘、提高機(jī)體免疫力的功效。我院中醫(yī)臨床用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性哮喘,以及喘息性支氣管炎等展示明顯的療效,但其發(fā)揮作用的現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天龍咳喘靈具有顯著抗哮喘動(dòng)物模型氣道高反應(yīng)與防治氣道重構(gòu)作用,與該

2、復(fù)方含有豐富的黃酮類(lèi)化合物有關(guān)。對(duì)天龍咳喘靈中黃酮類(lèi)成分進(jìn)行募集純化,測(cè)得其總黃酮的含量為28.03％。
　　中藥復(fù)方制劑是由多味中藥合理搭配,通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮其治療作用的。單一的有效化學(xué)成分并不能闡釋中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的物質(zhì)機(jī)理,中藥復(fù)方的藥效來(lái)自于多種化學(xué)成分多靶點(diǎn)的相互協(xié)同和調(diào)節(jié)作用。中藥復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是各類(lèi)有效成分保持適宜的濃度范圍和比例,通過(guò)煎煮等制備形成一個(gè)整體進(jìn)而發(fā)揮作用。因此,本實(shí)驗(yàn)在原有工作的基

3、礎(chǔ)上進(jìn)一步系統(tǒng)鑒定分析天龍咳喘靈的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為用現(xiàn)代分子藥理學(xué)理論揭示該復(fù)方抗哮喘等治療的機(jī)制奠定物質(zhì)基礎(chǔ),并為其二次開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　第一部分:天龍咳喘靈中槲皮素的含量測(cè)定
　　1.建立適合的槲皮素的含量測(cè)定方法。
　　2.通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)來(lái)考察水解溫度、水解時(shí)間和鹽酸濃度這三個(gè)因素對(duì)天龍咳喘靈中槲皮素含量測(cè)定的影響,篩選出天龍咳喘靈的最佳水解條件。
　　第二部分:

4、天龍咳喘靈中三萜類(lèi)化合物及其甘草酸的含量測(cè)定
　　1.應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定天龍咳喘靈中三萜類(lèi)化合物的含量。
　　2.應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定天龍咳喘靈中甘草酸的含量。
　　第三部分:天龍咳喘靈中總酚酸和阿魏酸的含量測(cè)定
　　1.應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),采用兩種不同的處理方法測(cè)定天龍咳喘靈中總酚酸的含量。
　　2.應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定天龍咳喘靈中阿魏酸的含量。
　　第四部分:天龍咳喘靈中木脂素

5、的含量測(cè)定
　　應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),建立適合的天龍咳喘靈中木脂素的含量測(cè)定方法。
　　結(jié)果:
　　第一部分:天龍咳喘靈中槲皮素的含量測(cè)定
　　1.采用高效液相色譜法測(cè)定天龍咳喘靈中槲皮素的含量時(shí),選擇C18色譜柱,流動(dòng)相為無(wú)水甲醇-濃度0.4%磷酸溶液(45-55,V/V),其在0.0168～0.0840mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為99.83%,RSD為2.03%,測(cè)得槲皮

6、素的含量為13.0mg/g。
　　2.通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可知,水解溫度、水解時(shí)間、鹽酸濃度這3個(gè)因素對(duì)槲皮素含量測(cè)定的影響主次順序依次為水解時(shí)間>水解溫度>鹽酸濃度。由方差分析表可知水解時(shí)間的影響時(shí)顯著的,而水解溫度和鹽酸濃度的影響是相對(duì)不顯著的。由正交試驗(yàn)得出的最佳水解條件為15%鹽酸(w/w),85℃水解90min。
　　第二部分:天龍咳喘靈中三萜類(lèi)化合物及其甘草酸的含量測(cè)定
　　1.采用紫外-可見(jiàn)分光光

7、度法測(cè)定天龍咳喘靈中三萜類(lèi)化合物的含量時(shí),選擇香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法,測(cè)定波長(zhǎng)為589nm,其在0.084～0.504mg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為98.91%,RSD為1.83%,測(cè)得三萜類(lèi)物質(zhì)含量為14.3mg/g。
　　2.采用高效液相色譜法測(cè)定天龍咳喘靈中甘草酸的含量時(shí),選擇C18色譜柱,流動(dòng)相為甲醇-0.2mol/L醋酸銨-冰醋酸(64:35:1),檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm,流速1.0ml/m

8、in,其在0.1～0.6μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9998),平均回收率為99.28%,RSD為1.58%,測(cè)得甘草酸的含量為0.0544mg/g。
　　第三部分:天龍咳喘靈中總酚酸及其阿魏酸的含量測(cè)定
　　1.采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定天龍咳喘靈中總酚酸的含量時(shí),選擇十二烷基硫酸鈉-鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法,測(cè)定波長(zhǎng)為783nm,其在0.066～0.231mg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為98

9、.88%,RSD為1.34%,測(cè)得總酚酸含量為0.6227mg/mg;未顯色法測(cè)定天龍咳喘靈中總酚酸的含量時(shí),測(cè)定波長(zhǎng)為320nm,其在0.012～0.072mg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=1),平均回收率為98.01%,RSD為1.52%,測(cè)得總酚酸含量為89.7mg/g。
　　2.采用高效液相色譜法測(cè)定天龍咳喘靈中阿魏酸的含量時(shí),選擇C18色譜柱,流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸(30:70),檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm,流速1.0ml/min

10、,其在0.0252～0.504μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為99.39%,RSD為1.40%,測(cè)得阿魏酸含量為0.0091mg/g。
　　第四部分:天龍咳喘靈中木脂素的含量測(cè)定
　　采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定天龍咳喘靈中木脂素的含量時(shí),選擇變色酸-濃硫酸顯色法,測(cè)定波長(zhǎng)為570nm,其在0.005~0.030mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為100.18%,RSD為1.

11、21%,測(cè)得木脂素的含量為2.27mg/g。
　　結(jié)論:
　　1.以中醫(yī)藥理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)哮喘治療藥物藥理學(xué)理論為導(dǎo)向,建立了應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法結(jié)合高效液相色譜法定量分析復(fù)方天龍咳喘靈有效部位群及主要代表性有效組分的方法。
　　2.初步鑒定出復(fù)方天龍有效部位及代表性有效組分主要包括:總黃酮(槲皮素)、三萜類(lèi)(甘草酸)、總酚酸(阿魏酸、綠原酸等)以及木脂素等,并進(jìn)行了量化分析。
　　3.研究從復(fù)方天龍咳喘靈的