高尿酸影響小鼠脂肪細胞 3T3-L1的數(shù)字基因表達譜分析及誘導(dǎo)胰島素抵抗的分子機制.pdf

1、背景：
　　尿酸是嘌呤堿在人體內(nèi)代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物。一般情況下，人體內(nèi)的尿酸合成和代謝處于平衡狀態(tài)，當尿酸合成增加或代謝減少時，可導(dǎo)致高尿酸血癥。隨著人們生活方式的改變，高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究表明，尿酸水平升高與多種代謝紊亂如痛風(fēng)、心血管疾病、腎臟疾病及代謝綜合癥等密切相關(guān)。高尿酸血癥常與糖代謝異常尤其是胰島素抵抗并存，參與糖尿病和心腦血管疾病的病理過程，最終誘發(fā)各種并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。已有研究表明高尿酸

2、血癥與胰島素抵抗密切相關(guān)，尿酸值升高是糖尿病及胰島素抵抗的一個良好的預(yù)測指標。脂肪組織是脂肪儲存組織，在糖脂代謝中扮演著至關(guān)重要的角色。同時，脂肪組織也是一個內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪因子。脂肪細胞在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中擔任著重要的作用。脂肪細胞的功能障礙會導(dǎo)致氧化損傷，增加游離脂肪酸的釋放，最終導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)高尿酸可通過增加ROS水平，抑制肝細胞、心肌細胞和骨骼肌細胞的胰島素信號通路IRS1-AKT

3、途徑，引起胰島素抵抗。然而，高尿酸對脂肪細胞的糖脂代謝、氧化應(yīng)激、脂肪因子及細胞分化等的影響以及分子機制尚不清楚。我們需要通過不同的實驗方法進一步研究高尿酸影響脂肪細胞的病理生理學(xué)機制。
　　目的：
　　分析高尿酸處理后小鼠脂肪細胞3T3-L1數(shù)字基因表達譜的變化，全面研究高尿酸對脂肪細胞糖脂代謝等相關(guān)方面的影響；進一步研究高尿酸在脂肪細胞胰島素抵抗產(chǎn)生中的作用及分子機制。
　　方法：
　?、庞煤?0％小牛血清的

4、高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠脂肪細胞3T3-L1，培養(yǎng)至細胞密度達100%后融合兩天，更換含1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、10μg/ml胰島素、10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2天，再換為含10μg/ml胰島素、10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2天，最后換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化4天。顯微鏡下觀察到超過90%的細胞含脂滴，則誘導(dǎo)成功。⑵用15mg/dL的尿酸作用于小鼠脂

5、肪細胞3T3-L124h，次日使用TRIzol法提取RNA，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行數(shù)字基因表達譜（DGE）分析。方法如下：使用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；使用NanoPhotometer spectrophotometer檢測 RNA純度(OD260/280及 OD260/230比值)；使用 Qubit2.0 Fluorometer進行RNA濃度精確定量；使用Agilent2100 bioana

6、lyzer精確檢測RNA完整性。使用Illumina測序檢測差異基因。采用 clusterProfiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析，Reactome通路富集分析。⑶小鼠脂肪細胞3T3-L1經(jīng)10mmol/L NAC過夜處理，12mg/dL的尿酸溶液處理30分鐘后，換為含10μmol/L DCFH-DA的無血清DMEM培養(yǎng)基,37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5分鐘, PBS液洗滌后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞的熒光

7、強度；或者使用流式細胞儀進行檢測。⑷小鼠脂肪細胞3T3-L1經(jīng)含10mmol/L NAC的無血清低糖DMEM過夜處理。12mg/dL尿酸作用30min，改為含熒光標記葡萄糖100μmol/L2-NBDG、12mg/dL尿酸和1μmol/L胰島素的PBS溶液培養(yǎng)45min，使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞；或者使用流式細胞儀進行檢測。⑸用不同濃度、不同作用時間的尿酸，作用小鼠脂肪細胞3T3-L1，使用蛋白免疫印跡（Western Blottin

8、g）檢測尿酸處理后小鼠脂肪細胞3T3-L1胰島素信號通路蛋白AKT（S473）的磷酸化水平，確定尿酸的最佳作用濃度及時間。⑹小鼠脂肪細胞3T3-L1經(jīng)10mmol/L NAC的無血清高糖DMEM過夜處理，12mg/dL尿酸處理30min,胰島素100nmol/L處理5min，提取蛋白后使用蛋白免疫印跡（Western Blotting）檢測IRS1(S307)、AKT（S473）磷酸化水平。⑺小鼠脂肪細胞3T3-L1經(jīng)15mg/dL的尿

9、酸處理24h，次日，收集對照組和實驗組的細胞培養(yǎng)液，使用脂聯(lián)素Elisa試劑盒檢測培養(yǎng)液中的脂聯(lián)素濃度。
　　結(jié)果：
　?、偻ㄟ^DGE分析，高尿酸引起小鼠脂肪細胞3T3-L1表達差異性顯著基因共187個，其中上調(diào)差異基因90個，下調(diào)差異基因97個。②通過差異基因GO分析，差異基因富集主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脂質(zhì)代謝、染色質(zhì)重構(gòu)、脂肪細胞分化等過程；差異基因KEGG分析，差異基因富集主要參與糖酵解/糖異生、PPAR信號途徑、溶酶體

10、、過氧化物酶體、磷酸肌醇代謝、二羧酸代謝、氨基酸生物合成、多糖降解等途徑；差異基因Reactome分析，差異基因富集主要參與細胞質(zhì)IP3和IP4的合成、鞘糖脂代謝、FGFR的下游信號激活、PI3K途徑、PIP3-AKT途徑等。③與糖脂代謝相關(guān)的差異基因43個，包括28個上調(diào)和15個下調(diào)。與活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異基因9個，包括8個上調(diào)和1個下調(diào)。與胰島素信號通路相關(guān)的差異基因7個，包括2個上調(diào)和5個下調(diào)。與脂肪細胞分化相關(guān)的差異基因

11、7個，包括5個上調(diào)和2個下調(diào)。④高尿酸誘導(dǎo)小鼠脂肪細胞3T3-L1 ROS水平升高，抗氧化劑 NAC抑制高尿酸誘導(dǎo)的ROS水平升高。⑤高尿酸抑制小鼠脂肪細胞3T3-L1胰島素刺激的2-NBDG攝取，抗氧化劑NAC改善小鼠脂肪細胞3T3-L1的2-NBDG攝取。⑥高尿酸升高 IRS1(S307)磷酸化水平，降低 AKT（S473）磷酸化水平。使用抗氧化劑NAC可恢復(fù)高尿酸升高的 IRS1(S307)磷酸化水平和抑制的 AKT（S473）的