高尿酸影響小鼠脂肪細(xì)胞 3T3-L1的數(shù)字基因表達(dá)譜分析及誘導(dǎo)胰島素抵抗的分子機(jī)制.pdf

1、背景：
　　尿酸是嘌呤堿在人體內(nèi)代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物。一般情況下，人體內(nèi)的尿酸合成和代謝處于平衡狀態(tài)，當(dāng)尿酸合成增加或代謝減少時，可導(dǎo)致高尿酸血癥。隨著人們生活方式的改變，高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究表明，尿酸水平升高與多種代謝紊亂如痛風(fēng)、心血管疾病、腎臟疾病及代謝綜合癥等密切相關(guān)。高尿酸血癥常與糖代謝異常尤其是胰島素抵抗并存，參與糖尿病和心腦血管疾病的病理過程，最終誘發(fā)各種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。已有研究表明高尿酸

2、血癥與胰島素抵抗密切相關(guān)，尿酸值升高是糖尿病及胰島素抵抗的一個良好的預(yù)測指標(biāo)。脂肪組織是脂肪儲存組織，在糖脂代謝中扮演著至關(guān)重要的角色。同時，脂肪組織也是一個內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪因子。脂肪細(xì)胞在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中擔(dān)任著重要的作用。脂肪細(xì)胞的功能障礙會導(dǎo)致氧化損傷，增加游離脂肪酸的釋放，最終導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)高尿酸可通過增加ROS水平，抑制肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的胰島素信號通路IRS1-AKT

3、途徑，引起胰島素抵抗。然而，高尿酸對脂肪細(xì)胞的糖脂代謝、氧化應(yīng)激、脂肪因子及細(xì)胞分化等的影響以及分子機(jī)制尚不清楚。我們需要通過不同的實驗方法進(jìn)一步研究高尿酸影響脂肪細(xì)胞的病理生理學(xué)機(jī)制。
　　目的：
　　分析高尿酸處理后小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1數(shù)字基因表達(dá)譜的變化，全面研究高尿酸對脂肪細(xì)胞糖脂代謝等相關(guān)方面的影響；進(jìn)一步研究高尿酸在脂肪細(xì)胞胰島素抵抗產(chǎn)生中的作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　?、庞煤?0％小牛血清的

4、高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)100%后融合兩天，更換含1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、10μg/ml胰島素、10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2天，再換為含10μg/ml胰島素、10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2天，最后換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化4天。顯微鏡下觀察到超過90%的細(xì)胞含脂滴，則誘導(dǎo)成功。⑵用15mg/dL的尿酸作用于小鼠脂

5、肪細(xì)胞3T3-L124h，次日使用TRIzol法提取RNA，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）分析。方法如下：使用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；使用NanoPhotometer spectrophotometer檢測 RNA純度(OD260/280及 OD260/230比值)；使用 Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行RNA濃度精確定量；使用Agilent2100 bioana

6、lyzer精確檢測RNA完整性。使用Illumina測序檢測差異基因。采用 clusterProfiler軟件對差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析，Reactome通路富集分析。⑶小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1經(jīng)10mmol/L NAC過夜處理，12mg/dL的尿酸溶液處理30分鐘后，換為含10μmol/L DCFH-DA的無血清DMEM培養(yǎng)基,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5分鐘, PBS液洗滌后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光

7、強度；或者使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。⑷小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1經(jīng)含10mmol/L NAC的無血清低糖DMEM過夜處理。12mg/dL尿酸作用30min，改為含熒光標(biāo)記葡萄糖100μmol/L2-NBDG、12mg/dL尿酸和1μmol/L胰島素的PBS溶液培養(yǎng)45min，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞；或者使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。⑸用不同濃度、不同作用時間的尿酸，作用小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1，使用蛋白免疫印跡（Western Blottin

8、g）檢測尿酸處理后小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1胰島素信號通路蛋白AKT（S473）的磷酸化水平，確定尿酸的最佳作用濃度及時間。⑹小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1經(jīng)10mmol/L NAC的無血清高糖DMEM過夜處理，12mg/dL尿酸處理30min,胰島素100nmol/L處理5min，提取蛋白后使用蛋白免疫印跡（Western Blotting）檢測IRS1(S307)、AKT（S473）磷酸化水平。⑺小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1經(jīng)15mg/dL的尿

9、酸處理24h，次日，收集對照組和實驗組的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用脂聯(lián)素Elisa試劑盒檢測培養(yǎng)液中的脂聯(lián)素濃度。
　　結(jié)果：
　?、偻ㄟ^DGE分析，高尿酸引起小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1表達(dá)差異性顯著基因共187個，其中上調(diào)差異基因90個，下調(diào)差異基因97個。②通過差異基因GO分析，差異基因富集主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脂質(zhì)代謝、染色質(zhì)重構(gòu)、脂肪細(xì)胞分化等過程；差異基因KEGG分析，差異基因富集主要參與糖酵解/糖異生、PPAR信號途徑、溶酶體

10、、過氧化物酶體、磷酸肌醇代謝、二羧酸代謝、氨基酸生物合成、多糖降解等途徑；差異基因Reactome分析，差異基因富集主要參與細(xì)胞質(zhì)IP3和IP4的合成、鞘糖脂代謝、FGFR的下游信號激活、PI3K途徑、PIP3-AKT途徑等。③與糖脂代謝相關(guān)的差異基因43個，包括28個上調(diào)和15個下調(diào)。與活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異基因9個，包括8個上調(diào)和1個下調(diào)。與胰島素信號通路相關(guān)的差異基因7個，包括2個上調(diào)和5個下調(diào)。與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的差異基因

11、7個，包括5個上調(diào)和2個下調(diào)。④高尿酸誘導(dǎo)小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1 ROS水平升高，抗氧化劑 NAC抑制高尿酸誘導(dǎo)的ROS水平升高。⑤高尿酸抑制小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1胰島素刺激的2-NBDG攝取，抗氧化劑NAC改善小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1的2-NBDG攝取。⑥高尿酸升高 IRS1(S307)磷酸化水平，降低 AKT（S473）磷酸化水平。使用抗氧化劑NAC可恢復(fù)高尿酸升高的 IRS1(S307)磷酸化水平和抑制的 AKT（S473）的