以Fc和LTB為載體的豬口蹄疫亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)被國際獸疫局(OIE)列為A類疾病，是一種偶蹄動物易感的熱性，急性，高度接觸性傳染病?？谔阋弑l(fā)會造成政治和經(jīng)濟上相當(dāng)嚴重的損失。我國目前通過接種滅活苗疫苗的方法來控制該病的流行，滅活疫苗雖然具有良好的免疫原性，但存在病毒滅活不徹底甚至活毒逃逸等不安全因素。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，多種新型疫苗因為安全可靠，容易進行質(zhì)量控制等優(yōu)點吸引了更多研究人員的注意。其中，重組亞單位疫苗只

2、含有完整病毒的有效的免疫結(jié)構(gòu)，能夠刺激產(chǎn)生免疫保護的同時還保證了疫苗使用的安全性，同時其生產(chǎn)制備手段已趨于成熟，生產(chǎn)成本低廉，因而是獸用疫苗的最佳研究和發(fā)展方向。
　　VP1蛋白是FMDV唯一刺激能產(chǎn)生中和抗體的最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，尤其是G-H環(huán)的140～160和200～213氨基酸殘基，它含有的包含B細胞抗原表位141-160aa及200-213aa,是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的免疫表位，從而產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。因此VP1蛋白是研究口

3、蹄疫亞單位疫苗的理想抗原。
　　國內(nèi)學(xué)者已有報道成功的以豬免疫球蛋白IgG Fc為載體的豬FMDV亞單位疫苗，并具有較好的免疫保護效果，但是由于融合表達產(chǎn)物為包涵體，工藝無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，本實驗以前人的研究成果為基礎(chǔ)，利用新型的原核系統(tǒng)表達平臺嘗試對融合產(chǎn)物進行可溶表達，并對重組蛋白的免疫原性進行鑒定，為重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用進行初步的探索。本研究以FMDV O/MYA98株結(jié)構(gòu)蛋白VP1的141～160aa-200～213a

4、a為目標(biāo)基因，以豬免疫球蛋白IgG Fc片段和大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB為載體，利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達了兩種FMDV VP1的重組蛋白，并對重組蛋白的免疫原性進行了初步研究。具體主要研究內(nèi)容如下:
　　1.以豬IgG Fc為載體的O型FMDV VP1蛋白主要抗原表位的表達與鑒定。
　　本實驗選取FMDV O/MYA98株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上141-160aa及200-213aa的序列，以豬免疫球蛋白IgG Fc片段為載體，

5、連接pQZ載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQZ-Fc-loop，利用大腸桿菌可溶性表達平臺CVC1102對融合基因進行表達。SDS-PAGE鑒定表明，獲得的重組蛋白Fc-loop大小為42kDa,存在于超聲破碎后上清中，為可溶性蛋白。Western-bloting分析顯示，F(xiàn)c-loop能與兔抗FMDV VP1特異性陽性血清呈陽性反應(yīng)。
　　2.以LTB為載體的O型FMDV VP1蛋白主要抗原表位的表達與鑒定。
　　本實驗選取FMDV

6、O/MYA98株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上141-160aa及200-213 aa的序列，以大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB為載體，連接pQZ載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQZ-LTB-loop，利用大腸桿菌可溶性表達平臺CVC1102對融合基因進行表達。SDS-PAGE鑒定表明，獲得的重組蛋白LTB-loop大小為23 kDa,為可溶性蛋白。Western-bloting分析顯示，LTB-loop能與兔抗FMDV VP1特異性陽性血清呈陽性反應(yīng)。
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7、.FMDV VP1重組蛋白免疫原性的初步研究。
　　利用BCA法對獲得的兩種重組蛋白進行蛋白定量，總蛋白分別為為2mg/ml、1mg/ml，將定量后的重組蛋白與206佐劑混合乳化后，獲得試驗性疫苗，4℃保存?zhèn)溆?。本實驗選取ICR小鼠，分為5組，分別頸背部皮下多點接種免疫200μl/只Fc-loop、LTB-loop重組蛋白疫苗、添加免疫增強劑CVC1302的Fc-loop、LTB-loop重組蛋白疫苗，最后組作為空白對照組。14天

8、后加強免疫，一免后14、22、28、55天眼眶采血，ELISA檢測FMDV VP1抗體水平。結(jié)果表明:pQZ-Fc-loop、pET-LTB-loop均能刺激免疫小鼠產(chǎn)生特異性抗體，pQZ-Fc-loop的抗體水平高于pET-LTB-loop的抗體水平，添加免疫增強劑CVC1302后抗體水平獲得不同程度的提高。
　　4.FMDV VP1重組蛋白的初步純化。
　　為了提高未經(jīng)純化的重組亞單位疫苗的免疫保護效果，需要對重組蛋白進