淋球菌NspA-LTB核酸疫苗的構建及其免疫活性的初步研究.pdf

1、目的：克隆淋球菌NspA基因和大腸桿菌LTB基因，用人工接頭將NspA與LTB基因融合，構建真核表達載體pcDNA3.1(-)/LTB-NspA，并用殼聚糖包裹后用作核酸疫苗；核酸疫苗通過生殖道免疫BALB/c小鼠，檢測其所誘發(fā)的體液免疫（特別是粘膜免疫）和細胞免疫應答水平，為研制新型、高效的淋球菌核酸疫苗提供實驗依據。 方法：分別以淋球菌WHO-A株的NspA核酸序列和大腸桿菌H44815株LTB核酸序列為模板，PCR擴增Ns

2、pA全基因和LTB基因；同時以編碼6個氨基酸的18個寡核苷酸作為接頭，通過重組PCR法將NspA與LTB基因融合，PCR產物經酶切純化后克隆至pcDNA3.1(-)真核表達載體中；陽性克隆經雙酶切及測序鑒定，大量制備質粒純化后作為粘膜核酸疫苗。同時構建原核表達重組體pET-30a/NspA、pET-30a/LTB及pET-30a/LTB-NspA，在E.coli BL21中表達重組蛋白。以殼聚糖包裹的pcDNA3.1(-)/NspA和p

3、cDNA3.1(-)/LTB-NspA生殖道免疫4w齡BALB/c小鼠，免疫熒光組化法檢測淋球菌NspA基因和大腸桿菌LTB基因在小鼠生殖道粘膜內的表達，間接ELISA法檢測免疫小鼠生殖道粘膜分泌液中抗NspA的sIgA抗體水平和血清中抗NspA的IgG抗體水平，ELISA雙抗體夾心法檢測脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平，MTT比色法檢測脾淋巴細胞增殖反應。 結果：成功構建了pcDNA3.1(-)/NspA和pcDNA3.1(

4、-)/LTB-NspA真核表達載體，以殼聚糖包裹后作為疫苗通過生殖道免疫小鼠后，生殖道粘膜組織免疫熒光法檢測到了NspA、LTB蛋白的表達。末次免疫后小鼠粘膜分泌液中檢測到了抗NspA的sIgA抗體，其水平隨免疫時間延長而增高，并且含粘膜佐劑的核酸疫苗pcDNA3.1(-)/LTB-NspA免疫組小鼠sIgA水平明顯高于免疫不含粘膜佐劑的核酸疫苗pcDNA3.1(-)/NspA組小鼠(P<0.05)。兩核酸疫苗免疫組小鼠血清中均產生了一

5、定水平的IgG抗體，兩組間IgG水平無明顯差異(P>0.05)。核酸疫苗免疫組小鼠脾淋巴細胞經PHA刺激后，培養(yǎng)上清中IFN-γ含量明顯升高[pcDNA3.1(-)/NspA組達135.86±13.97pg/mL，pcDNA3.1(-)/LTB-NspA組達140.18±20.54pg/mL]，與空質粒組(45.24±5.31pg/mL)和PBS組(5.75±1.12pg/mL)之間有顯著性差異(P<0.01)，兩核酸疫苗免疫組間無明顯

6、差異(P>0.05)。脾淋巴細胞增殖反應測定，核酸疫苗pcDNA3.1(-)/LTB-NspA組和pcDNA3.1(-)/NspA組小鼠脾淋巴細胞經PHA刺激后，刺激指數分別為(1.573±0.012)和(1.518±0.010)，明顯高于空質粒組(1.134±0.007)和PBS組(1.044±0.005) (P<0.01)，兩核酸疫苗免疫組間無明顯差異(P>0.05)。 結論： (1)成功克隆了淋球菌NspA基因和

7、大腸桿菌LTB基因，并構建了pcDNA3.1(-)/NspA和含粘膜佐劑的pcDNA3.1(-)/LTB-NspA核酸疫苗。 (2)成功構建了原核表達重組體pET-30a/NspA、pET-30a/LTB及pET-30a/ LTB-NspA，重組蛋白NspA 和LTB-NspA在E.coli BL21中獲得了表達。 (3)殼聚糖包裹的核酸疫苗pcDNA3.1(-)/NspA和pcDNA3.1(-)/LTB-NspA經