大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)對(duì)羅非魚鏈球菌口服疫苗免疫增強(qiáng)效果的初步研究.pdf

1、口服免疫是一種簡(jiǎn)單而有效誘導(dǎo)粘膜免疫的免疫方式，但由于缺乏良好的運(yùn)輸系統(tǒng)和吸收系統(tǒng)，很大程度上限制了口服疫苗的發(fā)展。大腸毒素不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)是一個(gè)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)免疫的信號(hào)和載體分子，因而通常被作為佐劑應(yīng)用于口服疫苗。為了研究LTB對(duì)羅非魚鏈球菌口服疫苗的免疫增強(qiáng)效果，本研究通過對(duì)已構(gòu)建的LTB重組酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，探索重組LTB最佳表達(dá)時(shí)間并檢測(cè)其安全性，并建立羅非魚抗體檢測(cè)間接ELISA方法，為羅非魚抗體的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，

2、最后將LTB與鏈球菌口服疫苗聯(lián)合口服免疫羅非魚，研究LTB對(duì)羅非魚的免疫增強(qiáng)效果，為鏈球菌口服疫苗免疫佐劑開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)已構(gòu)建的重組LTB KM71畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及LTB毒性實(shí)驗(yàn)，探討重組LTB的最佳表達(dá)時(shí)間以及表達(dá)量，檢測(cè)了LTB對(duì)羅非魚的安全性。實(shí)驗(yàn)顯示，重組LTB在畢赤酵母中得到有效表達(dá)，最佳的表達(dá)時(shí)間為96h，表達(dá)量為2.716mg/mL。LTB對(duì)羅非魚在灌胃初期具有輕微刺激性，但能夠

3、作為羅非魚腸道粘膜佐劑使用。在羅非魚血清及粘膜抗體水平間接ELISA檢測(cè)方法建立的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，羅非魚血清抗體間接ELISA檢測(cè)的最佳反應(yīng)溫度為22℃，抗原包被濃度為5.5μg/mL，待測(cè)血清、多抗的稀釋度和酶標(biāo)二抗的稀釋度分別為1/400、1/2000和1/8000。
　　 在對(duì)LTB的免疫增強(qiáng)效果研究的試驗(yàn)中，以羅非魚鏈球菌口服疫苗0.2×109cells/尾、0.2×108 cells/尾和0.2×107cells/尾三個(gè)口

4、服劑量水平以及LTB口服劑量1.68μg/尾、0.84μg/尾和0.17μg/尾3個(gè)處理水平設(shè)計(jì)聯(lián)合疫苗，并通過口服免疫羅非魚，評(píng)價(jià)LTB的免疫增強(qiáng)效果及聯(lián)合疫苗相對(duì)保護(hù)率。結(jié)果表明，LTB能夠促進(jìn)血清以及腸道粘膜抗體水平，對(duì)鏈球菌口服疫苗有佐劑效應(yīng)。當(dāng)疫苗口服劑量為0.2×108cells/尾，LTB口服劑量為0.84μg/尾的組合時(shí)達(dá)到最佳免疫效果，該組合能在免疫后期穩(wěn)定持續(xù)高效的提高血清和腸道粘膜抗體應(yīng)答水平，并且使羅非魚在免疫后

5、第10d、20d和30d相對(duì)保護(hù)率分別達(dá)到65.00％、68.42％和64.71％。腸道粘膜抗體水平和LTB的含量成正比，但在免疫期內(nèi)同—LTB含量實(shí)驗(yàn)組的抗體水平波動(dòng)幅度較大。檢測(cè)LTB對(duì)羅非魚非特異性免疫效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)LTB可顯著提高溶菌酶和堿性磷酸酶水平，對(duì)酸性磷酸酶無(wú)顯著影響，但對(duì)超氧化物歧化酶表現(xiàn)出抑制作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LTB雖然對(duì)羅非魚灌胃前期具有微弱刺激性，但總體可提高魚體的免疫力，與羅非魚鏈球菌口服疫