表面展示豬不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒疫苗載體研究.pdf

1、與其他的病毒載體系統(tǒng)比較，桿狀病毒用于基因轉移和疫苗遞送擁有顯著的優(yōu)勢，如插入外源片段容量大、操作簡單、生物安全性高（不具有整合性和哺乳動物致病性）以及哺乳動物中不存在針對桿狀病毒的先天免疫。攜帶哺乳動物病毒活性啟動子的重組桿狀病毒（BacMam virus）用于哺乳動物細胞的轉基因而被廣泛研究。
　　然而，桿狀病毒用于哺乳動物的基因轉移仍面臨兩大瓶頸:哺乳動物補體系統(tǒng)的清除和哺乳動物細胞轉導效率低，尤其是針對樹突細胞(DCs)、

2、巨噬細胞(MΦ)、B細胞和T細胞等免疫細胞表現出極低的轉導效率。這在一定程度上限制了桿狀病毒載體疫苗的效力。本實驗室前期研究發(fā)現，表面展示豬IgG1 Fc可通過增強桿狀病毒補體逃逸和轉導哺乳動物細胞從而提高桿狀病毒載體疫苗的效力。IgG Fc在體內主要通過轉運途徑(FcRn)、補體途徑(C1q)和免疫細胞識別途徑（FcγRI）來調控誘導免疫反應。考慮到豬不同亞型IgG Fc在結構上存在明顯差異，在與上述三種途徑識別受體的結合能力方面也存

3、在差異。本研究通過嘗試構建表面展示不同亞型IgG Fc的桿狀病毒，探究不同亞型IgG Fc是否具有類似IgG1 Fc的功能，并篩選更具佐劑潛力的IgG Fc亞型，為構建高效的拮抗補體重組桿狀病毒疫苗載體提供理論支持和技術手段。本研究取得了以下結果:
　　1.重組桿狀病毒的構建和鑒定
　　本試驗基于MultiBac桿狀病毒表達系統(tǒng)，通過在載體pFBDM-P10-gp64SP-vsvgED多克隆位點中插入不同亞型IgG Fc構建

4、桿狀病毒轉移載體，經脂質體介導的方法轉染Sf9昆蟲細胞包裝重組桿狀病毒。Western blot和間接免疫熒光分析顯示目的基因正確正確表達并定位在重組桿狀病毒表面。這些結果表明，成功構建了8種展示不同亞型IgGFc的VSV-G假型化的重組桿狀病毒。
　　2.重組桿狀病毒的豬血清補體系統(tǒng)拮抗能力和體外轉基因表達評價
　　通過體外試驗比較展示不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒在豬血清中的存活率，與對照病毒BV-vsvg相比(16

5、.59％)，展示豬不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒存活率均顯著提高，其中BV-vsvg-pFc2(52％)最高，其次是BV-vsvg-pFc3(49.39％)和BV-vsvg-pFc(47.2％)。而展示人IgG1 Fc的重組病毒（BV-vsvg-hFc和BV-vsvg-rhFc）存活率(17.04％～23.9％)與對照病毒沒有顯著差異。轉導IEC細胞后，轉基因表達結果顯示，展示豬IgG Fc不同亞型的重組桿狀病毒在轉導效率和轉基因表

6、達上較對照病毒均有顯著增強，其中BV-vsvg-pFc3最高，其次是BV-vsvg-rpFc3、BV-vsvg-pFc2和BV-vsvg-pFc。而由于種屬性差異，展示人IgG1 Fc的重組桿狀病毒BV-vsvg-hFc和BV-vsvg-rhFc在轉基因表達水平上與對照病毒BV-vsvg均無顯著差異。
　　3.展示Fc重組桿狀病毒與Fc激活型受體FcγRI結合能力比較
　　通過構建FcγRI表達載體，成功表達和純化了豬IgG

7、 Fc激活型受體FcγRI。選取在補體逃逸和轉基因表達兩個方面都有良好表現的3株重組桿狀病毒，以重組FcγRI作為包被物，通過ELISA分析比較其與FcγRI的結合能力，其中BV-vsvg-pFc3與FcγRI結合能力最強，其次是BV-vsvg-pFc2和BV-vsvg-pFc。
　　綜上，本研究構建了8種展示不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒，補體拮抗能力、體外轉基因表達和與激活型受體FcγRI結合活性三個評價指標顯示，表面展示