乳腺導管內(nèi)癌中miRNA的表達譜分析及miRNA-132功能研究.pdf

1、目的：
　　 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、經(jīng)多階段、多步驟漸進演化的復雜過程。該過程涉及到眾多原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的突變和/或失活。最近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著不可或缺的重要作用，常發(fā)揮致癌因子或抑癌因子的作用，可以解釋腫瘤的發(fā)病機制和提供新的腫瘤治療策略，現(xiàn)已成為腫瘤分子方向研究的熱點。乳腺癌是一種異質(zhì)性非常高的惡性腫瘤，不同miRNA在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演不同角色，即使同一

2、miRNA在乳腺癌不同階段可能發(fā)生不同的表達變化。迄今為止，有關(guān)miRNA在乳腺癌癌前病變中表達水平改變的研究甚少。在我們的研究中，通過miRNA芯片和實時定量PCR技術(shù)系統(tǒng)研究miRNA在乳腺癌癌前病變(導管內(nèi)癌，DuctalCarcinomainsitu，DCIS)中表達水平的改變。并且希望找到在乳腺癌早期發(fā)揮特定作用的miRNA，進而對這些新發(fā)現(xiàn)的miRNA進行功能學研究，探討這些miRNA在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，以期為乳腺

3、癌的早期發(fā)現(xiàn)提供有效的腫瘤標志物，并且為今后的乳腺癌的治療研究方向提供線索。
　　 方法：
　　 選取天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2007-2012年間經(jīng)乳腺外科手術(shù)所得的21對凍存乳腺組織，每一對包含來自同一患者的DCIS組織及相應乳腺癌旁正常組織（Adjacentnormaltissues，NATs），從中選取1對凍存組織進行miRNA芯片分析，根據(jù)芯片檢測結(jié)果篩選出兩種組織中表達差異的miRNA，利用實時定量PCR技術(shù)

4、在21對凍存組織中進行驗證。然后從所有驗證結(jié)果中選出在DCIS腫瘤組織中表達水平發(fā)生明顯改變的miRNA-132進行體外功能學研究。利用MDA-MB-231、MCF-7和BT-549三種乳腺癌細胞系，通過CCK-8試劑、克隆形成實驗和流式細胞術(shù)對miRNA-132在乳腺癌細胞分裂增殖過程中扮演的角色進行系統(tǒng)的功能學研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過miRNA芯片對樣本進行檢測，與相應NATs相比，檢測出在852個miR

5、NA在兩種組織中存在表達水平差異，但以差異倍數(shù)FC(FoldChange)≥3做為表達差異篩選標準，僅有155個miRNA表達差異符合我們的篩選標準，并且通過這些差異表達的miRNA我們可以明顯區(qū)分兩種組織。
　　 2.在miRNA芯片基礎(chǔ)上，我們從中選取表達水平發(fā)生較大改變的miRNA，利用實時定量PCR方法在21對組織中分別進行驗證，統(tǒng)計結(jié)果顯示miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-10b、miRNA-132

6、、miRNA-409、miRNA-154和miRNA-382表達水平發(fā)生的改變具有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　 3.miRNA-132進行體外實驗功能學驗證，在CCK-8實驗中顯示其在MDA-MB-231、MCF-7和BT-549細胞中具有抑制乳腺癌細胞增殖的作用;細胞克隆形成實驗顯示其在MDA-MB-231和MCF-7細胞中具有抑制乳腺癌細胞克隆的形成的作用;在流式細胞術(shù)實驗中顯示其在BT-549細胞系中可以將細胞周期阻滯在S/G

7、2的階段。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過miRNA芯片的測量和實時定量PCR的驗證工作，證實在與乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)的miRNA中，miRNA-125b、miRNA-145和miRNA-10b在乳腺癌早期階段(DCIS)表達水平就已經(jīng)發(fā)生明顯的改變，且三者均發(fā)生低水平表達改變。
　　 2.通過miRNA芯片的測量和實時定量PCR的驗證工作，證實既往在乳腺癌領(lǐng)域中研究較少的miRNA-132、miRNA-409、mi