有機磷降解酶OPHC2在畢赤酵母中高效表達及酶活性功能與結構關系的研究.pdf

1、常用于化學殺蟲劑的有機磷化合物，它可以破壞乙酰膽堿酯酶的活性，導致乙酰膽堿的堆積，從而引發(fā)一系列神經中毒癥狀，甚至死亡。同時，有機磷農藥的廣泛應用造成的環(huán)境污染也是不容忽視的。有機磷降解酶是一類可以破壞有機磷分子的磷酯鍵，最終使有機磷化合物毒性消失的酶。因此，一方面為了實現有機磷降解酶的大規(guī)模工業(yè)化生產，本研究嘗試在畢赤酵母中高效表達具有獨立知識產權和優(yōu)良酶學性質的有機磷降解酶OPHC2。另一方面，為了了解有機磷降解酶的催化機制，對有機

2、磷降解酶活性功能與蛋白結構的關系進行了研究。 本研究將來源于Pseudomonaspseudoalcaligenes的有機磷降解酶基因ophc2連入畢赤酵母表達載體pPIC9，轉化GS115，通過篩選共得到了93株具有有機磷降解酶活性的酵母菌株，其中表達量最高的4株重組子為8＃，45＃，50＃，89＃。將這些表達量高的重組子進行3L和3噸發(fā)酵罐的發(fā)酵研究，甲醇誘導120h后，表達量分別達到5.5g/L和10g/L，有機磷降解酶活

3、性分別達到10.1U/mL和20U/mL，這是目前發(fā)表的有機磷降解酶的最高表達量。重組有機磷降解酶OPHC2被分泌到培養(yǎng)液中，占總蛋白的90％以上，采用一步分子篩純化就可以得到純的重組酶。重組酶最適反應溫度為65℃，最適反應pH為9，具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定很好，75℃下保溫30min，相對酶活性仍有66.8％。畢赤酵母中表達的重組有機磷降解酶OPHC2具有高表達量、高活性、易純化、良好的熱穩(wěn)定性等特點，為商業(yè)化生產

4、奠定了堅實的基礎。 采用易錯PCR建立了OPHC2的隨機突變體庫，篩選104個重組子，得到突變酶e-10，酶的活性完全喪失，經測序發(fā)現它的T138變?yōu)锳。序列比對和結構預測結果表明OPHC2活性中心附近有四段保守區(qū)，該氨基酸位于第二段保守區(qū)內，因此進一步對該點進行定點突變。分別選擇將蘇氨酸突變?yōu)榕c它最相似的絲氨酸、酸性氨基酸谷氨酸和苯環(huán)上帶有羥基的酪氨酸，結果T138S突變酶保持了與原酶一樣的活性，T138Y和T138E突變酶酶

5、活性下降極大。同時，熒光定量PCR和光譜分析結果表明這個位點的突變不影響基因的表達和酶蛋白的結構，綜合以上結果推測這個氨基酸是維持OPHC2催化活性的關鍵氨基酸殘基。 此外，根據預測的四段保守區(qū)及相似酶MPH的晶體結構研究結果，選取位于保守區(qū)段的H139、H141、H226、T227，用重疊PCR的方法得到突變體H139A、H141L、H226A、T227L、T227S，發(fā)現H139A、H141L、H226A、T227L，酶活性

6、完全喪失，T227S酶活性無改變； 同時，熒光定量PCR和光譜分析來研究結果表明，這些氨基酸的突變沒有影響基因的表達，也沒有使酶的結構發(fā)生變化； 綜合這些結果推測這四個氨基酸都是維持OPHC2催化活性的關鍵氨基酸殘基。 本研究對底物結合口袋處的F111、M188、F265進行了突變研究，用重疊PCR的方法得到突變體F111A、M188A和F265A。突變酶比活性分別下降到了原酶的29.9％、7.4％、和24.4％

7、。同時，對M188定點飽和突變，篩選獲得M188F突變酶，該突變酶對甲基對硫磷的Kcat/Km值提高了2.48倍，說明此處的突變增加了底物與酶蛋白的親和力。熒光定量PCR和光譜分析結果表明這些點的突變沒有影響基因的表達，并且他們對酶的結構整體影響不大，僅產生了一些微調； 綜合這些研究結果，以及與已報道類似酶相比較，認為這三個氨基酸是酶與底物結合的關鍵氨基酸。 研究表明OPHC2中存在一個二硫鍵，分別突變C110和C146