黃粉蟲絲氨酸胰蛋白酶樣酶的基因克隆及在畢赤酵母中的表達和活性檢測.pdf

1、黃粉蟲(TenebriomolitorL.)在昆蟲分類學(xué)上隸屬于鞘翅目，擬步行蟲科，粉蟲甲屬。目前有關(guān)研究已經(jīng)證明，黃粉蟲體內(nèi)含有多種重要生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等;大量實驗也證明，以黃粉蟲為原料制成的保健品具有提高人體免疫力、抗疲勞、降低血脂、抗癌以及促進新陳代謝等功效。目前，國內(nèi)主要在其生物學(xué)特性和人工養(yǎng)殖技術(shù)方面有所研究，作為一種高蛋白營養(yǎng)品，對其功能性蛋白的研究較為罕見。國外對該蟲已引起廣泛關(guān)注，

2、已有對其消化酶的有關(guān)研究，和少量關(guān)于其具有抑菌和溶血栓作用方面的工作，但對黃粉蟲胰蛋白酶樣酶的提取、功能以及其基因方面的研究尚少，而對該基因的克隆表達的研究還未見報道。本論文的研究是在課題組前期對其纖溶酶基因進行克隆的基礎(chǔ)上，進一步探討黃粉蟲絲氨酸胰蛋白酶樣酶(TMTLSP)基因克隆并在畢赤酵母中表達。畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，具有高效表達外源蛋白的能力、完善的分泌系統(tǒng)和翻譯后加工機制，適于表達真核蛋白。
　　 本文采用了P

3、CR技術(shù)，以含有TMTLSPcDNA的質(zhì)粒作為模板，擴增出TMTLSP基因片段;將克隆獲得的目的基因插入到畢赤酵母表達載體pPIC9K中，經(jīng)測序無誤后，獲得重組表達質(zhì)粒pPIC9K-TMTLSP;將重組表達質(zhì)粒線性化后電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，經(jīng)篩選并PCR驗證獲得多拷貝整合型酵母工程菌;對工程菌進行發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)表達，取樣進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在26KD左右有陽性條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子沒有;經(jīng)纖溶平板實驗驗證，該表達蛋