蘋果內(nèi)參基因的篩選及三種潛隱性病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、病毒病嚴(yán)重影響蘋果的生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及果品質(zhì)量，尚無(wú)有效防治藥劑，樹體一旦侵染很難根除，繁育無(wú)病毒苗木實(shí)行無(wú)毒化栽培是其防治的最有效途徑。高效、靈敏、穩(wěn)定的病毒檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)蘋果無(wú)毒化栽培的重要技術(shù)保障之一。本研究在篩選出適用于蘋果的內(nèi)參基因的基礎(chǔ)上，分別建立了蘋果Actin基因及蘋果莖溝病毒、莖痘病毒、褪綠葉斑病毒三種蘋果潛隱性病毒的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，旨在為進(jìn)一步研究三種潛隱性病毒的侵染、增殖、分布以及時(shí)序

2、變化等規(guī)律提供有效的技術(shù)手段，并為蘋果病毒的多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、本研究采用SYB GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)Actin、TUB、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad5六個(gè)持家基因在蘋果幼葉、成齡葉、枝皮、根皮和種子中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)GeNorm軟件分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)內(nèi)參基因在五種不同組織器官中的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低排列順序?yàn)?Actin=UBQ＞G

3、APDH＞nad5＞TUB＞18SrRNA，Actin和UBQ為優(yōu)選內(nèi)參基因。
　　2、首次建立了蘋果Actin基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。本研究根據(jù)已公布的Actin基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，以體外轉(zhuǎn)錄的RNA為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)該方法的特異性、靈敏性和重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999，擴(kuò)增效率為106.5％;該方法的引物和探針特異性強(qiáng);檢測(cè)靈敏度為1

4、.48×10 copies·μL-1的cRNA，比常規(guī)RT-PCR高1000倍;重復(fù)性好，組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)均小于2.65％。
　　3、建立了蘋果莖溝病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。本研究根據(jù)蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)外殼蛋白基因(coat protein，cp)保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，以構(gòu)建的ASGV-cp重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

5、，并對(duì)該方法的特異性、靈敏性和重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999，擴(kuò)增效率為96.8％;該方法特異性好，與蘋果莖痘病毒（Applestem pitting virus，ASPV）、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果銹果類病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）均無(wú)交叉反應(yīng);靈敏度為10copies·μL-1，比常規(guī)RT-PCR高10

6、00倍;組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)均小于1％。表明該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)際樣品中ASGV的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。
　　4、建立了蘋果褪綠葉斑病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。根據(jù)ACLSV cp基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，以構(gòu)建的ACLSV-cp重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)該方法的特異性、靈敏性、重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，以ACLSV-cp重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)

7、曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999，擴(kuò)增效率為103.7％;建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法特異性好，與ASGV、ASPV和ASSVd均無(wú)交叉反應(yīng);靈敏度為100 copies·μL-1，比常規(guī)RT-PCR高100倍;組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)均小于0.84％。表明TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)際樣品中ACLSV的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。
　　5、建立了蘋果莖痘病毒TaqMan

8、探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。根據(jù)ASPVcp基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，以體外轉(zhuǎn)錄的RNA為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)該方法的特異性、靈敏性、重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0.996，擴(kuò)增效率為99％;該方法特異性好，與ASGV、ACLSV及ASSVd均無(wú)交叉反應(yīng);其最低檢測(cè)限為1.31×102 copies·μL-1，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍;組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)均小于1.85％。該