多重實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)馬鈴薯主要的真細(xì)菌病原菌.pdf

1、我國(guó)馬鈴薯的種植面積與產(chǎn)量均居世界首位,但是馬鈴薯的主要病害一直威脅著我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中主要的馬鈴薯真細(xì)菌病害有:馬鈴薯晚疫病(Phytophthora infestans(Mont.)deBary),馬鈴薯干腐病(Fusarium spp.),馬鈴薯黑痣病(Rhizoctonia solani Kühn),馬鈴薯軟腐病(Erwinia spp.),馬鈴薯青枯病(Ralstonia solanacearum)等。提高種薯的質(zhì)量,

2、檢測(cè)去除含有潛在病原危害的不合格種薯,是目前防控的主要方法。這就需要發(fā)展一種快速高效的病害檢測(cè)方法用以嚴(yán)格監(jiān)控種薯生產(chǎn)各環(huán)節(jié)以保證種薯質(zhì)量。最新發(fā)展的Real TimePCR由于其具有操作簡(jiǎn)單、快速便捷、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以上幾種重要的馬鈴薯真細(xì)菌病原菌保守序列設(shè)計(jì)了Taqman探針及引物。馬鈴薯晚疫病(Pi)、黑痣病(Rhs)和軟腐病(Ec)探針用JOE熒光標(biāo)記,干腐

3、病(Fz)、青枯病(Rs)以及馬鈴薯內(nèi)參基因(細(xì)胞色素氧化酶Cox)探針用FAM標(biāo)記。馬鈴薯內(nèi)參COX的引入在檢測(cè)過(guò)程中可以有效地避免因DNA提取失敗或PCR抑制從而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中分別用熒光染料SYRBGREENⅠ和上述標(biāo)記的Taqman探針建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR,并根據(jù)探針熒光標(biāo)記不同建立了雙重探針Real time PCR。雙重定量PCR的組合為:Rhs與Cox,Fz與Ec,Pi與Rs；Pi與Fz完全不能組合在一起。