蘋果α-法尼烯合成酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、虎皮病是蘋果、梨在低溫貯藏中后期發(fā)生的最嚴(yán)重的生理病害之一，這種生理病害不僅影響果實的食用品質(zhì)特別是外觀品質(zhì)，降低其商品價值，而且使果實抗病性降低，易感染病菌而腐爛，從而造成巨大的經(jīng)濟損失。實驗證明α-法尼烯是誘導(dǎo)虎皮病發(fā)生的重要因素。果皮中α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，調(diào)控此途徑的酶包括3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)，法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)，α-法尼烯合成酶(AFS)。其中AF

2、S是調(diào)控α-法尼烯合成的最直接的限速酶，它催化法尼基焦磷酸(FPP)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?法尼烯?？梢酝ㄟ^基因敲除方法調(diào)控此基因的表達(dá)，從而調(diào)控α-法尼烯的合成。 根據(jù)α-法尼烯合成酶基因全長序列設(shè)計特定引物，構(gòu)建正義和RNAi載體，轉(zhuǎn)化煙草和蘋果，研究α-法尼烯的表達(dá)情況；研究影響蘋果離體葉片的再生因子，完善蘋果再生體系；利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化蘋果，篩選蘋果新品種。主要結(jié)果如下： 1．利用RT-PCR．方法，從蘋果果皮中克隆蘋果

3、α-法尼烯合成酶基因(AFS)。 2．構(gòu)建了pBI-AFS正義表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，得到轉(zhuǎn)．AFS基因的煙草。 3．利用構(gòu)建pET-AFS原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制備抗體，western雜交結(jié)果顯示該基因在煙草中成功表達(dá)。 4．構(gòu)建α-法尼烯合成酶基因RNAi表達(dá)載體，進(jìn)行蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化。 5．通過研究基本培養(yǎng)基、激素配比、蔗糖濃度等對蘋果離體葉片再生不定芽的影響，優(yōu)化再生條件，完善蘋果再生體系。