玫煙色棒束孢幾丁質酶Ⅱ基因的克隆、表達及兩種幾丁質酶的誘導轉錄.pdf

1、蟲生真菌作為農(nóng)林生態(tài)系中昆蟲的重要致死因子，具有顯著的流行潛力，對維持生態(tài)平衡具有重要作用。有些蟲生真菌已被開發(fā)為真菌殺蟲劑，進而廣泛地應用于防治農(nóng)林害蟲。玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea作為一類較為常見的蟲生真菌，世界性分布，可寄生鱗翅目、同翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目等多類昆蟲。玫煙色棒束孢在北美和歐洲已被用于溫室害蟲的生物防治，目前已有真菌殺蟲劑產(chǎn)品登記注冊用于溫室粉虱、蚜蟲、薊馬和介殼蟲的防治。
　　 前

2、人研究表明，蟲生真菌中常常存在多個幾丁質酶，但各自在侵染中的作用主次尚未闡明。本課題組在先前的研究中，克隆獲得了一個玫煙色棒束孢的幾丁質酶Ifuchit1。在本研究中，我們運用RT-PCR和DNA步移技術從玫煙色棒束孢中又分離得到了一種新的幾丁質酶基因Ifuchit2，序列已遞交國際權威基因數(shù)據(jù)庫GenBank登錄，序列號為HQ267382。該基因全長1584bp，5′端非翻譯區(qū)111bp，3′端非翻譯區(qū)有202bp,開放閱讀框(ORF

3、)1272bp，編碼423個氨基酸。信號肽長度為22個氨基酸。其編碼蛋白理論分子量為46.57kDa，理論等電點為5.169。423個氨基酸中含強堿氨基酸37個（K，R），強酸氨基酸48個（D，E），疏水氨基酸150個（A，I，L，F(xiàn)，W，V），極性氨基酸119個（N，C，Q，S，T，Y）。通過Blast對保守區(qū)進行預測,發(fā)現(xiàn)該幾丁質酶基因含有幾丁質的活性位點（DGIDIDWE）和結合區(qū)域（SIGG），屬于糖基水解酶18家族。
　

4、　 又運用特異性PCR擴增和DNA步移技術，分別從玫煙色棒束孢中克隆得到幾丁質酶的基因組序列和上游序列。結構基因總長1425bp，擴出的結構基因DNA與其cDNA比較含有三個內含子，分別位于距離起始密碼子的121堿基至176堿基處，277堿基至331堿基處和380堿基至431堿基處，大小分別為54bp，53bp，51bp。在玫煙色棒束孢幾丁質酶Ifuchit2結構基因的基礎上，克隆得到了其上游序列。該基因上游序列大小為1794bp（序

5、列號：JF323024），其中有209bp與該基因cDNA序列相互重疊。序列分析表明，玫煙色棒束孢幾丁質酶Ifuchit2上游序列中，含有真核生物基因典型的TATA-盒，以及多個高度保守的潛在轉錄因子結合位點，如Oct1、GATA-1、GATA-2、CdxA等。另外，該上游序列還存在一些特異的應答元件，如熱激應答元件（HSE）、脅迫應答元件（STRE）等。
　　 將克隆獲得的玫煙色棒束孢幾丁質酶Ifuchit2基因連接到分泌性表

6、達載體pPIC9K 上后，通過電轉化，轉入畢赤酵母GS115。經(jīng)甲醇誘導144h，離心收集上清，測定酶活37.3U/ml。將表達后的幾丁質酶粗酶液，通過80％硫酸銨蛋白沉淀，離心收集沉淀，并用50mmol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解后，在相同的緩沖液中透析24h，離心棄沉淀。酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱進行蛋白純化。將具有活性的收集液采用PEG20000進行濃縮。最后以SDS-PAGE凝膠檢測該蛋白，得到分子量為

7、46kD左右，與預測的結果（46.57kDa）及相關報道結果相接近。
　　 玫煙色棒束孢RCEF3304菌株在粉狀幾丁質為誘導物的條件下，經(jīng)12h，36h，60h 誘導后，提取總RNA。同時根據(jù)幾丁質酶Ifuchit2基因和幾丁質酶Ifuchit1基因序列設計引物，利用Realtime-PCR熒光檢測技術比較兩種幾丁質酶基因在誘導前后自身轉錄水平以及兩者之間表達量變化的差異，結果表明兩種幾丁質酶基因經(jīng)誘導后，轉錄量均有所提高，且