玫煙色棒束孢幾丁質(zhì)酶Ⅱ基因的克隆、表達(dá)及兩種幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄.pdf

1、蟲生真菌作為農(nóng)林生態(tài)系中昆蟲的重要致死因子，具有顯著的流行潛力，對維持生態(tài)平衡具有重要作用。有些蟲生真菌已被開發(fā)為真菌殺蟲劑，進(jìn)而廣泛地應(yīng)用于防治農(nóng)林害蟲。玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea作為一類較為常見的蟲生真菌，世界性分布，可寄生鱗翅目、同翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目等多類昆蟲。玫煙色棒束孢在北美和歐洲已被用于溫室害蟲的生物防治，目前已有真菌殺蟲劑產(chǎn)品登記注冊用于溫室粉虱、蚜蟲、薊馬和介殼蟲的防治。
　　 前

2、人研究表明，蟲生真菌中常常存在多個(gè)幾丁質(zhì)酶，但各自在侵染中的作用主次尚未闡明。本課題組在先前的研究中，克隆獲得了一個(gè)玫煙色棒束孢的幾丁質(zhì)酶Ifuchit1。在本研究中，我們運(yùn)用RT-PCR和DNA步移技術(shù)從玫煙色棒束孢中又分離得到了一種新的幾丁質(zhì)酶基因Ifuchit2，序列已遞交國際權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫GenBank登錄，序列號(hào)為HQ267382。該基因全長1584bp，5′端非翻譯區(qū)111bp，3′端非翻譯區(qū)有202bp,開放閱讀框(ORF

3、)1272bp，編碼423個(gè)氨基酸。信號(hào)肽長度為22個(gè)氨基酸。其編碼蛋白理論分子量為46.57kDa，理論等電點(diǎn)為5.169。423個(gè)氨基酸中含強(qiáng)堿氨基酸37個(gè)（K，R），強(qiáng)酸氨基酸48個(gè)（D，E），疏水氨基酸150個(gè)（A，I，L，F(xiàn)，W，V），極性氨基酸119個(gè)（N，C，Q，S，T，Y）。通過Blast對保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該幾丁質(zhì)酶基因含有幾丁質(zhì)的活性位點(diǎn)（DGIDIDWE）和結(jié)合區(qū)域（SIGG），屬于糖基水解酶18家族。
　

4、　 又運(yùn)用特異性PCR擴(kuò)增和DNA步移技術(shù)，分別從玫煙色棒束孢中克隆得到幾丁質(zhì)酶的基因組序列和上游序列。結(jié)構(gòu)基因總長1425bp，擴(kuò)出的結(jié)構(gòu)基因DNA與其cDNA比較含有三個(gè)內(nèi)含子，分別位于距離起始密碼子的121堿基至176堿基處，277堿基至331堿基處和380堿基至431堿基處，大小分別為54bp，53bp，51bp。在玫煙色棒束孢幾丁質(zhì)酶Ifuchit2結(jié)構(gòu)基因的基礎(chǔ)上，克隆得到了其上游序列。該基因上游序列大小為1794bp（序

5、列號(hào)：JF323024），其中有209bp與該基因cDNA序列相互重疊。序列分析表明，玫煙色棒束孢幾丁質(zhì)酶Ifuchit2上游序列中，含有真核生物基因典型的TATA-盒，以及多個(gè)高度保守的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如Oct1、GATA-1、GATA-2、CdxA等。另外，該上游序列還存在一些特異的應(yīng)答元件，如熱激應(yīng)答元件（HSE）、脅迫應(yīng)答元件（STRE）等。
　　 將克隆獲得的玫煙色棒束孢幾丁質(zhì)酶Ifuchit2基因連接到分泌性表

6、達(dá)載體pPIC9K 上后，通過電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)144h，離心收集上清，測定酶活37.3U/ml。將表達(dá)后的幾丁質(zhì)酶粗酶液，通過80％硫酸銨蛋白沉淀，離心收集沉淀，并用50mmol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解后，在相同的緩沖液中透析24h，離心棄沉淀。酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱進(jìn)行蛋白純化。將具有活性的收集液采用PEG20000進(jìn)行濃縮。最后以SDS-PAGE凝膠檢測該蛋白，得到分子量為

7、46kD左右，與預(yù)測的結(jié)果（46.57kDa）及相關(guān)報(bào)道結(jié)果相接近。
　　 玫煙色棒束孢RCEF3304菌株在粉狀幾丁質(zhì)為誘導(dǎo)物的條件下，經(jīng)12h，36h，60h 誘導(dǎo)后，提取總RNA。同時(shí)根據(jù)幾丁質(zhì)酶Ifuchit2基因和幾丁質(zhì)酶Ifuchit1基因序列設(shè)計(jì)引物，利用Realtime-PCR熒光檢測技術(shù)比較兩種幾丁質(zhì)酶基因在誘導(dǎo)前后自身轉(zhuǎn)錄水平以及兩者之間表達(dá)量變化的差異，結(jié)果表明兩種幾丁質(zhì)酶基因經(jīng)誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)錄量均有所提高，且