凡納濱對蝦與WSSV侵染相關(guān)的細胞與基因功能分析.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)自20世紀90年代出現(xiàn)后,成為對蝦暴發(fā)性流行病的主要病毒性病原,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
　　WSSV是一種有囊膜病毒,其感染宿主細胞的第一步是囊膜與靶細胞膜的吸附,而后融合或者內(nèi)吞進入細胞,完成對細胞的侵染,現(xiàn)已有多個蛋白被報道參與感染,但該病毒感染的分子機制尚不清晰,也沒有有效的防治手段。本論文圍繞解析WSSV感染宿主的分子機制為主要研究目的,分別從WSSV多個囊膜蛋白和凡納濱對蝦重要造血

2、功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Runt基因入手。通過熒光顯微鏡觀察WSSV各囊膜蛋白是否能引起宿主細胞的內(nèi)吞作用。并使用熒光微球技術(shù),通過已知的受體蛋白對WSSV囊膜蛋白的細胞內(nèi)吞抑制實驗,進一步驗證與WSSV感染相關(guān)的各蛋白之間的相互作用關(guān)系。同時研究凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄因子Runt在受到外界病原侵入后的表達變化,以及重組蛋白注入對蝦體內(nèi)對感染W(wǎng)SSV病毒后的相對保護情況。通過本論文的研究,以期為闡明WSSV的侵染機制及途徑奠定基礎(chǔ)。
　　本論文

3、的主要研究內(nèi)容包括以下五個部分:
　　1、WSSV囊膜蛋白介導細胞內(nèi)吞實驗:FITC標記的重組WSSV囊膜蛋白VP24,VP26, VP28,VP31和VP37介導凡納濱對蝦不同組織細胞的內(nèi)吞作用鑒定。原代培養(yǎng)凡納濱對蝦的血淋巴,淋巴器官,上皮組織和造血組織細胞,在體外遷出后,和FITC標記的重組囊膜蛋白孵育,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),可以使血細胞發(fā)生內(nèi)吞作用的有VP24,VP28,VP31和VP37;可以使淋巴器官細胞發(fā)生內(nèi)吞作用

4、的有VP28和VP37;可以使甲殼下表皮細胞發(fā)生內(nèi)吞作用的有VP28,VP31和VP37;使造血組織細胞發(fā)生內(nèi)吞作用的有VP24,VP28和VP37。綜上所述,VP28和VP37均能單獨介導宿主細胞發(fā)生內(nèi)吞作用,在WSSV的侵染過程中發(fā)揮首要的入胞作用。
　　2、應(yīng)用熒光微球技術(shù)研究凡納濱對蝦血淋巴細胞與偶聯(lián)熒光微球的重組 WSSV囊膜蛋白的相互作用,并探究AK,Rab7和BP53以及多克隆抗體對VP31,VP28和VP37進入細

5、胞的影響作用。運用EDC法偶聯(lián)熒光微球和重組囊膜蛋白,通過流式細胞術(shù)檢測,結(jié)果顯示BP53對VP37進入血細胞有抑制作用,而Rab7和AK對VP28和VP31進入血細胞沒有起到抑制作用。VP28和VP37的多克隆抗體對VP28,VP37進入細胞有明顯抑制作用,而對VP31抗體對VP31進入細胞沒有抑制作用。說明血細胞對囊膜蛋白VP31的內(nèi)吞存在非特異性。通過實驗結(jié)果,我們可以推論,BP53作為VP37的受體在病毒侵染細胞過程中發(fā)揮重要作

6、用,而Rab7可能作為一種細胞因子,與VP28相互結(jié)合參與信號轉(zhuǎn)導并調(diào)節(jié)感染過程。
　　3、凡納濱對蝦Runt轉(zhuǎn)錄因子cDNA全長序列克隆:應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄和cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù),首次在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)中克隆并測序了一種Runt(lvrunt)基因全長。lvrunt cDNA全長1754bp,含有1個663bp長的開放閱讀框,編碼221個氨基酸,理論分子量為23.6 kDa,具有Ru

7、nt-family結(jié)構(gòu)域。對該基因的蛋白序列分析顯示,Lvrunt的氨基酸序列與軟尾太平喇蛄(Pacifastacus leniusculus)相似度為88.1％,與其它種類的氨基酸序列相似性在30%—52.4%范圍內(nèi),該蛋白表現(xiàn)較高的種間保守性。
　　4、lvrunt在凡納濱對蝦的組織表達特異性分析及注射對蝦造血激素(LvAST)和WSSV對其轉(zhuǎn)錄表達的影響:對凡納濱對蝦鰓、腸、肝胰腺、類淋巴、心臟、肌肉組織和血淋巴lvrunt

8、的轉(zhuǎn)錄特征進行分析,結(jié)果顯示該基因幾乎特異性地在血淋巴細胞中表達,而在其它組織中表達較低。肌肉注射重組蛋白 rLvAST6h后,或白斑綜合征病毒(WSSV)粗提液12h后均觀察到lvrunt轉(zhuǎn)錄表達水平顯著提高。
　　5、凡納濱對蝦Runt的原核表達及其對WSSV感染的體外中和實驗:構(gòu)建重組表達載體pBAD/gIIIA-lvrunt,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli內(nèi),加入0.02%L-阿拉伯糖于37℃誘導表達,通過SDS-PAGE和對