姜黃素通過(guò)激活PPARγ抑制大腸癌細(xì)胞的增殖.pdf

1、目的： 大腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，其發(fā)病率還有不斷增高的趨勢(shì)。姜黃素作為天然植物成分，幾乎無(wú)毒副作用，既往研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有預(yù)防大腸癌發(fā)生的作用[1，2]，但其抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不十分清楚。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）為配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，被配體激活后與維甲酸X受體（RXR）結(jié)合形成異源二聚體，再與DNA上PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控下

2、游靶基因包括COX-2，NF-кB等的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)多級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)糖脂代謝以及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等。本研究旨在研究姜黃素對(duì)大鼠大腸組織及人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞株過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達(dá)的影響，深入探討姜黃素在防治結(jié)腸腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。 方法： 1.模型建立：利用DMH誘導(dǎo)大鼠大腸癌模型，80只大鼠統(tǒng)一編號(hào)，隨機(jī)分成3組：①陰性對(duì)照組（20只）：標(biāo)準(zhǔn)固體飼料+皮下注射與DMH等體積的生理鹽水。

3、②陽(yáng)性對(duì)照組（30只）：標(biāo)準(zhǔn)固體飼料+DMH。③姜黃素組（30只）：含0.2％姜黃素的固體飼料+DMH。實(shí)驗(yàn)第12周每組處死5只，32周處死所有存活大鼠，評(píng)價(jià)藥物對(duì)大鼠大腸癌的防治效果并初步探討其預(yù)防機(jī)制。 2、細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清，100μ/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5％，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3

4、d用0.25％的胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、姜黃素加GW9662組、姜黃素組。 3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按1×104/孔密度接種于96孔板，每孔100μl，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。姜黃素和GW9662均以DMSO溶解，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度加于細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組、空白對(duì)照。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。GW9662提前30min加入。加藥培養(yǎng)12h，24h，

5、48h，72h后，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，37℃繼續(xù)孵育4h。吸去上清液，每孔加入DMSO200μl，震蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)孔/A對(duì)照孔×100％。 4.利用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡（Westernblotting）方法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠大腸癌組織PPARγ和COX-2的表達(dá)。 結(jié)果： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 1.1

6、姜黃素對(duì)DMH誘導(dǎo)大鼠大腸癌的影響：姜黃素能有效降低DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸癌的發(fā)生，姜黃素組荷瘤鼠的數(shù)量及大腸腫瘤的發(fā)生率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。姜黃素對(duì)DMH誘導(dǎo)大鼠大腸癌的抑制率為46.46％。姜黃素組大鼠大腸腫瘤的平均數(shù)量和平均體積也明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組。 1.2免疫組化檢測(cè)PPARγ和COX-2的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示陰性對(duì)照組大鼠大腸組織PPARγ呈較弱表達(dá)，DMH誘導(dǎo)大鼠組織腸上皮細(xì)胞PPARγ表達(dá)增強(qiáng)，可見

7、棕黃色顆粒。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，姜黃素組PPARγ表達(dá)顯著增強(qiáng)，主要集中于細(xì)胞核部位。COX-2免疫組化結(jié)果顯示DMH誘導(dǎo)大鼠組織大腸癌細(xì)胞COX-2表達(dá)增強(qiáng)，可見細(xì)胞漿棕黃色染色。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，姜黃素組COX-2表達(dá)較弱。 1.3姜黃素對(duì)大鼠大腸癌變過(guò)程中PPARγ和COX-2蛋白表達(dá)的影響：誘癌32W時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組及姜黃素組大腸癌組織PPARγ蛋白表達(dá)均明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，姜黃素組PPARγ

8、表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。 2.體外實(shí)驗(yàn)： 2.1姜黃素對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響：利用MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明姜黃素可以抑制體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性，隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。而同時(shí)加入PPARγ的特異性抑制劑GW9662時(shí)，則姜黃素對(duì)細(xì)胞的抑制作用減弱。 2.2姜黃素對(duì)HT29細(xì)胞PPARγ和COX-2表達(dá)的影響：West

9、ernblotting結(jié)果顯示：姜黃素處理組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞PPARγ的表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。應(yīng)用PPARγ特異性阻斷劑GW9662能夠部分阻斷姜黃素對(duì)HT29細(xì)胞PPARγ，表達(dá)的上調(diào)作用（P<0.05）。同時(shí)結(jié)果還表明，與對(duì)照組相比，姜黃素處理后HT29細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01），這種作用可以被PPARγ特異性阻斷劑GW9662所抑制（P<0.01）。 結(jié)論： 1.姜黃