PTEN對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其信號(hào)機(jī)制研究.pdf

1、大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是常見的惡性腫瘤，全球每年新增病例近1000000例，492000例死亡。隨著經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國(guó)大腸癌每年發(fā)病率也快速遞增，特別是大城市上升趨勢(shì)更為顯著。大腸癌男女發(fā)病率等同，在40歲以后發(fā)病危險(xiǎn)度隨著年齡增加而遞增；資料顯示我國(guó)大腸癌男性發(fā)病率約為16.2/100000，女性約為14.5/100000，大腸癌已經(jīng)成為我國(guó)致死性腫瘤中最常見的死亡原因之一。

2、然而，大腸癌的治療效果并不理想，在所有的病人中約有半數(shù)患者治療失敗。大腸癌傳統(tǒng)治療方法，即外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療方法的不斷發(fā)展和完善，在延長(zhǎng)患者生存期和提高患者生存質(zhì)量方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步；但是手術(shù)和放療是局部治療，難以控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，化療藥物往往缺乏組織選擇性和特異性，對(duì)骨髓等正常人體重要器官和組織產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，在過去幾十年，大腸癌的五年生存率一直徘徊在40～50%左右。因此，探尋大腸上皮細(xì)胞癌變，演化和轉(zhuǎn)移

3、的機(jī)制，特別是尋找早期腫瘤標(biāo)志物，以期早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)大腸癌的生物學(xué)進(jìn)程，對(duì)大腸癌的治療具有重要的意義。 本研究在系統(tǒng)地檢測(cè)PTEN在大腸黏膜正常組織-大腸息肉-大腸腺瘤-原發(fā)性大腸癌組織中的表達(dá)差異和分布特點(diǎn)基礎(chǔ)上，構(gòu)建了pc-DNA3.1-PTEN表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸癌LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞，觀察上調(diào)大腸癌細(xì)胞PTEN表達(dá)后對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)了PI3K通路下游的Akt蛋白、FoxO轉(zhuǎn)錄因子

4、家族蛋白及相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)變化，探討PTEN可能參與大腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的信號(hào)通路，旨在為發(fā)現(xiàn)大腸癌基因治療新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 材料與方法: 一、PTEN在大腸癌癌變過程中的表達(dá)及臨床意義。 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PTEN在大腸黏膜正常組織、大腸增生性息肉、大腸腺瘤以及原發(fā)性大腸癌組織中的表達(dá)情況，并分析PTEN表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。 二、PTEN表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

5、 1、轉(zhuǎn)染細(xì)胞和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)參照Invitrogen公司的Lipofectamine2000TM產(chǎn)品說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后24h培養(yǎng)基中加入1000μg/ml G418進(jìn)行篩選。形成陽性單細(xì)胞克隆群落后，用尖吸管吸取單克隆陽性細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4周后以含500μg/ml G418的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。 2、pc-DNA3.1-PTEN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后效應(yīng)檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcriptio

6、n polymerase chain reaction，RT-PCR）和免疫蛋白質(zhì)印跡（western blot）檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變。 3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定細(xì)胞株建立后，各組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)0h-96h，CCK-8法檢測(cè)上調(diào)PTEN表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞LoVo和SW480增殖的影響。 5細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上調(diào)PTEN表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞LoVo和SW480細(xì)胞周期

7、的影響。 6細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上調(diào)PTEN表達(dá)對(duì)5-Fu誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞凋亡的影響。 三、PTEN表達(dá)參與大腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的信號(hào)通路研究。 Western-Blot檢測(cè)上調(diào)PTEN表達(dá)后總蛋白中Akt及p-Akt的表達(dá)水平的變化。作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，同時(shí)檢測(cè)FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的表達(dá)水平變化，即胞漿蛋白p-FoxO1（FKHR，Ser25

8、6）、p-FoxO3a（FKHRL1，Ser253）、p-FoxO4（AFX，Ser193）和胞核蛋白FoxO1（FKHR）、FoxO3a（FKHRL1）、FoxO4（AFX）的表達(dá)變化。FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的變化，Western-Blot進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1、cdk4、cdk6、p27/Kip1的表達(dá)水平變化。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 所有結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)

9、。免疫組化半定量結(jié)果采用等級(jí)相關(guān)的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test）；數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），細(xì)胞增殖采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，組間多重比較LSD方法進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 一、PTEN在大腸癌癌變過程中的表達(dá)及臨床意義。 免疫組化結(jié)果顯示PTEN表達(dá)主要定位于大腸病變組織上

10、皮細(xì)胞的細(xì)胞漿。在大腸正常黏膜、大腸增生性息肉、大腸腺瘤和大腸癌組織中的PTEN蛋白表達(dá)有顯著性差異（P<0.05）。統(tǒng)計(jì)分析顯示在大腸癌中PTEN蛋白與患者的腫瘤分化程度無關(guān)（P>0.05）。 二、上調(diào)PTEN表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響。 1、PTEN真核表達(dá)質(zhì)粒pc-DNA3.1-PTEN經(jīng)酶切鑒定，所插入的片段與預(yù)期目的片段大小一致，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)，BLAST序列對(duì)比證實(shí)是PTEN基因mRNACDS序列。

11、 2、pc-DNA3.1-PTEN表達(dá)質(zhì)粒和pc-DNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞后，經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞克隆株，分別命名為：LoVo pc-DNA3.1-PTEN； LoVo pc-DNA3.1； SW480 pc-DNA3.1-PTEN； SW480 pc-DNA3.1。 3、表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PTEN mRNA和

12、蛋白表達(dá)變化情況。與LoVo pc-DNA3.1、SW480pc-DNA3.1相比，LoVo pc-DNA3.1-PTEN和SW480 pc-DNA3.1-PTEN均能夠顯著增強(qiáng)了PTEN蛋白的表達(dá)。 4、應(yīng)用CCK-8法連續(xù)檢測(cè)各組細(xì)胞0h-96h的增值情況，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，24h、48h、72h、96h時(shí)轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-PTEN表達(dá)質(zhì)粒的LoVo、SW480細(xì)胞增殖速度顯著減慢（P<0.05），說明上

13、調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可顯著減慢LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞的惡性增值。 5、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-PTEN表達(dá)質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞出現(xiàn)顯著的G1期細(xì)胞阻滯（P<0.05），同時(shí)伴有顯著的S期細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.05）。說明上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可顯著抑制大腸癌細(xì)胞周期進(jìn)展，減慢大腸癌細(xì)胞的惡性增殖速度。 6、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，未用5-Fu處理的各組細(xì)

14、胞培養(yǎng)48h均未檢測(cè)到明顯的Annexin V陽性凋亡細(xì)胞，LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞分別用0.01μmol/ml5-Fu和0.03μmoUml5-Fu處理48h后，陰性對(duì)照組細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-PTEN的LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞組均出現(xiàn)顯著的Annexin V陽性凋亡細(xì)胞（P<0.05），說明上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可以顯著增加大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物5-Fu的敏感性。 三、PTEN表達(dá)參與大腸

15、癌細(xì)胞增殖與凋亡的信號(hào)通路研究 通過Western-Blot檢測(cè)PI3K下游參與細(xì)胞增殖與凋亡的信號(hào)通路蛋白的變化。結(jié)果提示，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-PTEN表達(dá)質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞的Akt和p-Akt的表達(dá)量明顯降低（P<0.05），說明上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可以顯著降低有活性的Akt蛋白的表達(dá)。 結(jié)論: 1、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示PTEN表達(dá)從大腸正常黏膜-大腸增生性息肉-

16、大腸腺瘤-大腸癌依次降低，提示PTEN在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 2、上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可以抑制大腸癌LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞的增殖。 3、上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可以引起大腸癌細(xì)胞G1期阻滯，S期細(xì)胞數(shù)量減少，抑制惡性增殖。 4、上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可以增強(qiáng)大腸癌LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。 5、上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)可以降低Akt的活性，進(jìn)而增強(qiáng)了FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族的活性。