水產(chǎn)病原菌粘附相關(guān)基因的鑒定與功能分析.pdf

1、病原菌對(duì)宿主組織表面或細(xì)胞的粘附是其感染早期的關(guān)鍵步驟。對(duì)許多致病菌而言，首先要通過粘附素粘附到宿主的敏感受體，在機(jī)體局部產(chǎn)生毒素或侵入宿主表皮，最終滲透到宿主內(nèi)部，引發(fā)疾病。粘附已被視為致病菌重要的毒力因子之一。國(guó)內(nèi)外關(guān)于致病菌粘附的研究主要集中在人類致病菌上，水產(chǎn)養(yǎng)殖中致病菌粘附的研究還較為缺乏，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌粘附機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。
　　本文首先以海水養(yǎng)殖業(yè)中重要的致病菌河流弧菌為研究對(duì)象，采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)構(gòu)建了河流弧

2、菌粘附缺陷突變體庫，采用間接 ELISA技術(shù)篩選得到5株突變株，菌液 PCR鑒定為轉(zhuǎn)座子插入引起的突變。進(jìn)一步采用染色體步移技術(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。通過序列分析，其中19號(hào)、23號(hào)、60號(hào)三個(gè)突變株插入位點(diǎn)分別為還原型NO轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因、乙二醛酶基因、和β-1,4-甘露聚糖酶基因，而34號(hào)突變株的突變基因未找到同源序列，88號(hào)突變株沒有獲得得插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。本研究還對(duì)突變株進(jìn)行趨化、成膜等生物學(xué)性狀的研究，結(jié)果表明，突變株對(duì)

3、大黃魚表皮粘液的趨化能力和生物膜形成能力與野生株相比都有顯著性差異，其中，23號(hào)突變株趨化能力最弱，而19號(hào)突變株生物膜形成能力最弱。
　　其次，本文對(duì)另外一種重要水產(chǎn)病原菌嗜水氣單胞菌的粘附機(jī)制進(jìn)行了研究。同樣采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽序列篩選到一株粘附能力顯著下降的突變株A77，染色體步移技術(shù)獲得A77菌株中轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)序列的同源基因?yàn)閒lgN，該基因編碼的蛋白被認(rèn)為具有III型鞭毛蛋白輸出伴侶的功能，同時(shí)也認(rèn)為該蛋白是抗σ因子FlgM

4、的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。為了進(jìn)一步了解嗜水氣單胞菌flgN基因在細(xì)菌粘附中的功能，我們構(gòu)建了突變株A77的flgN補(bǔ)償菌株，并對(duì)野生株、突變株和補(bǔ)償株的運(yùn)動(dòng)性、粘附性和生物膜形成等生能功能進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，突變株的運(yùn)動(dòng)性、對(duì)粘液的粘附能力以及生物膜形成能力都與野生株有顯著性差異，而這些表型在補(bǔ)償株中都得到回復(fù)。結(jié)果預(yù)示flgN基因在嗜水氣單胞菌粘附宿主過程中可通過影響運(yùn)動(dòng)來影響細(xì)菌的粘附，并進(jìn)一步影響細(xì)菌在宿主表面形成生物膜，從而有可能對(duì)細(xì)