大鼠慢性神經(jīng)痛相關(guān)基因的篩選、鑒定與功能分析.pdf

1、脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)行使復(fù)雜的功能，這些高度精確腦功能的執(zhí)行依賴于基因表達(dá)變化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)mRNA在組成上相當(dāng)復(fù)雜，超過50﹪的mRNAs由低豐度表達(dá)轉(zhuǎn)錄本組成。這些低豐度表達(dá)基因大部分都是非常重要的生物效應(yīng)器，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行非常重要。因此，鑒定并研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)低豐度表達(dá)基因及其功能對于神經(jīng)科學(xué)家來說是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。 疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)。國際疼痛研究學(xué)會(IASP)將疼痛定義為“是一種與組織損傷或潛在

2、損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗(yàn)”。慢性神經(jīng)痛是臨床上的一大難題，很難治愈。脊髓和腦的很多區(qū)域以及很多基因都參與神經(jīng)痛形成過程。然而，到目前為止，慢性神經(jīng)痛形成的分子機(jī)制還不是很清楚。 大量的解剖學(xué)和生理學(xué)研究表明，初級感覺傳入信息在空間和時(shí)間上的轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在初級感覺神經(jīng)元與脊髓背角內(nèi)的投射神經(jīng)元之間，并且受多種因素的影響。在外周神經(jīng)受到損傷產(chǎn)生痛敏的過程中，很多基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及翻譯水平上都發(fā)生了很大的變化。在轉(zhuǎn)錄

3、水平上，幾百個(gè)基因的表達(dá)被上調(diào)或下調(diào)，這些基因表達(dá)的變化是痛覺過敏產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。利用分子生物學(xué)技術(shù)來尋找和發(fā)現(xiàn)促進(jìn)痛覺過敏形成的基因?qū)τ谖覀兝斫饴陨窠?jīng)痛形成的機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)痛藥物的分子靶點(diǎn)都是至關(guān)重要的。 CCI模型是研究慢性神經(jīng)痛常用的一個(gè)模型。因此，我們提取大鼠慢性神經(jīng)痛CCI模型L4-5段脊髓膨大部的mRNA，反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記探針，與大鼠腦cDNA文庫構(gòu)建的低豐度表達(dá)亞庫制作成的cDNAmicroarray雜交，利用差減雜

4、交原理，來篩選與慢性神經(jīng)痛形成相關(guān)的基因。 通過cDNAmicroarray篩選的基因，結(jié)合NorthernBlot和原位雜交技術(shù)，我們考察了部分基因在大鼠的脊髓及大腦的表達(dá)模式。根據(jù)其在大鼠的脊髓以及大腦的表達(dá)模式，我們重點(diǎn)對RSEP4和RSEP1這兩個(gè)基因進(jìn)行了鑒定與功能分析。 RSEP4基因是一個(gè)特異性表達(dá)在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的新基因，位于染色體的Xq34區(qū)域，其cDNA的全長為2006bp，包含一個(gè)501個(gè)核苷

5、酸的ORF，編碼167個(gè)氨基酸蛋白。原位雜交結(jié)果顯示，RSEP4主要表達(dá)在脊髓灰質(zhì)中，在脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)樱琕層的小的感覺神經(jīng)元以及腹角的大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中都具有很高水平的表達(dá)，在海馬的CA1，CA3和DG區(qū)以及小腦的浦金野氏細(xì)胞層也有很高水平的表達(dá)。融合蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明RSEP4蛋白是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白。這些結(jié)果提示，RSEP4基因可能是一個(gè)具有重要功能的基因。 RSEP1基因是CCI大鼠慢性神經(jīng)痛相關(guān)的一個(gè)新基因。它位于染

6、色體1q54的區(qū)域，其ORF長426bp，編碼一個(gè)在各物種間高度保守的142個(gè)氨基酸的蛋白，其氨基酸序列和人、小鼠、果蠅以及線蟲的同源相似性分別是100﹪，98﹪，39﹪和31﹪。NorthernBlot和原位雜交的結(jié)果顯示，在脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)?，V層的小的感覺神經(jīng)元以及腹角的大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中都具有很高水平的表達(dá)，在海馬的CA1，CA3和DG區(qū)也有很高水平的表達(dá)。融合蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明RSEP1蛋白是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白。在脊髓L4-5腰