卷柏提取物降脂保肝作用及對(duì)HUVEC細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、　　卷柏為蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植物卷柏(Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring)的全草。為了解卷柏物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)室前期,對(duì)卷柏化學(xué)成分進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究,從中分離得到大量的黃酮類、木脂素類、核苷類和其他多酚類化合物成分；活性研究采用去卵巢大鼠模型研究卷柏雌激素作用時(shí)發(fā)現(xiàn)卷柏提取物具有降脂活性,且正丁醇部位降脂活性最佳?？紤]工藝要適合工業(yè)化大生

2、產(chǎn),采用新的卷柏提取方法為：卷柏70%乙醇回流提取得到總部位,將總部位上聚酰胺柱,依次以水、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脫,洗脫液減壓濃縮、干燥得各洗脫部位,并通過糖尿病大鼠模型和高脂血癥大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)卷柏降脂降糖活性主要集中于卷柏 80%乙醇部位(即黃酮類化合物),該部位具有抗氧化和清除自由基,降膽固醇、降血脂、降糖、改善胰島素抵抗等多種功效。
　　工藝通過中試驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其成本較高,因此在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)卷柏的提取方法改為：

3、95%乙醇回流藥渣水提法,卷柏全草 95%乙醇回流提取,提取物減壓濃縮干燥得到 95%乙醇部位。95%乙醇提取后的藥渣用水煎煮,水煎液減壓濃縮干燥得到藥渣水提物。
　　本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,以卷柏80%乙醇部位為對(duì)照,并采用新的提取方法對(duì)卷柏提取物干預(yù)和治療非酒精性肝損傷進(jìn)行研究,以期篩選出卷柏黃酮降脂保肝作用的最優(yōu)劑量及卷柏黃酮富集的最佳提取方法,同時(shí)為明確卷柏黃酮在預(yù)防和治療非酒精性肝損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)

4、。
　　第一部分 卷柏提取物對(duì)飲食誘導(dǎo)肝損傷大鼠預(yù)防和治療作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：建立 Wistar大鼠飲食誘導(dǎo)肝臟脂肪變性模型,初探卷柏提取物降脂保肝作用機(jī)制。
　　方法：成年Wistar大鼠70只,雌雄各半,體重為(200±20) g,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,隨機(jī)分出10只為正常對(duì)照組；其余動(dòng)物腹腔注射60萬單位維生素D3的同時(shí)給予高脂飼料,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食。造模開始后干預(yù)組在造模的同時(shí)給藥,治療組造模成功后

5、給藥。
　　給藥12周后處死老鼠,測(cè)定體重、肝重,計(jì)算肝指數(shù)；取血清測(cè)定生化、肝功、血流變、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)指標(biāo)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定脂肪酸β氧化相關(guān)蛋白—肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CTP-Ⅰ)和脂酰輔酶A合成酶(ACS)的活性；光鏡和電鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：給藥12周后,干預(yù)實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清生化指標(biāo)及肝功指標(biāo)等顯著升高,血清MDA含量增加,SOD含量降低(與正常組比

6、P﹤0.01),全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)顯著升高,紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著減低,但紅細(xì)胞壓積沒有變化；肝臟CTP-1和ACS水平顯著減低(與正常組比P﹤0.01),給藥組各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善,其中以卷柏95%部位和卷柏80%Ⅱ部位作用最好。病理切片HE染色光鏡照片發(fā)現(xiàn),正常組肝組織切片肝組織功能基本正常；模型組肝細(xì)胞形成了以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變,給藥后各組肝臟病理改變一定的改善作用。
　　治療組造模一月后模型組大鼠出現(xiàn)了廣泛

7、的細(xì)胞內(nèi)小泡性脂肪變性,說明造模成功。給藥12周后,治療實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清生化指標(biāo)及肝功指標(biāo)等顯著升高,血清MDA含量增加,SOD含量降低(與正常組比P﹤0.01),全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)顯著升高,紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著減低,但紅細(xì)胞壓積沒有變化；肝臟CTP-1和ACS水平顯著減低(與正常組比P﹤0.01),給藥組各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善,其中以卷柏95%部位和卷柏80%Ⅱ部位作用最好。病理切片HE染色光鏡照片發(fā)現(xiàn),正常組肝組織切片肝

8、組織功能基本正常；模型組肝細(xì)胞形成了以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變,卷柏提取物對(duì)各組大鼠肝臟病理改變有明顯的改善作用。觀察電鏡表現(xiàn)的嚴(yán)重程度和病理一致,即隨著肝組織病理變化的加重電鏡下的改變也呈加重趨勢(shì)。
　　結(jié)論：卷柏黃酮對(duì)高脂飼料引起的脂代謝紊亂及肝細(xì)胞脂肪變性具有較好的干預(yù)和治療作用,且具較好的量效關(guān)系。
　　第二部分 卷柏提取物及穗花杉雙黃酮對(duì) HUVEC細(xì)胞增殖的影響
　　目的：觀察卷柏總黃酮、穗花杉雙黃酮

9、對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響,為動(dòng)脈粥樣硬化引起的心肌和肢體缺血的促血管新生治療提供理論依據(jù)。
　　方法：采用MTT法檢測(cè)不同濃度卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對(duì) HUVEC細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；Western blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：不同濃度的卷柏總黃酮(1、5、10、15、20μg·mL-1)和穗花杉雙黃酮(0.3、1、2、4、5μg