大鼠局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良IIId模型可行性研究及縫隙連接蛋白43表達(dá)分析.pdf

1、背景:癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管病以外的第二大疾病，共約有25％的藥物難治性癲癇需手術(shù)治療，經(jīng)手術(shù)治療的患者中約有75％的兒童癲癇和約25％的成人癲癇由局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(Focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD)所引起。FCD被認(rèn)為是大腦皮層形成過程中，神經(jīng)元的增殖、移行、皮層組建等正常程序受到干擾所致。2011年國際抗癲癇聯(lián)盟對FCD做出最新分類，認(rèn)為生后早期任何后天獲得性損害，包括外傷、炎癥及缺血性損害等均可

2、造成FCD，并稱其為FCDⅢd型。
　　 縫隙連接（Gap Junction，GJ）是由相鄰兩個細(xì)胞的細(xì)胞膜上相互對應(yīng)的半通道組成，相鄰細(xì)胞胞漿由中間連接小體對接而連通，目前認(rèn)為是相鄰細(xì)胞間唯一能進(jìn)行物質(zhì)和信息直接交換的通道，該通道是非選擇性的離子通道，僅可以允許直徑小于1.5納米或者分子量小于1200道爾頓的小分子物質(zhì)和電流在其間通過，能促進(jìn)細(xì)胞間的電化學(xué)偶聯(lián)和細(xì)胞間的新陳代謝?？p隙連接蛋白(Connexin，CX)是由多基因

3、家族編碼的一大類膜蛋白，CX在哺乳動物種間具有高度的保守性，大鼠CX氨基酸序列與人類具有高度同源性，382個氨基酸中僅有9個不同，同源性高達(dá)97％。至今在人類及哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)15種，腦內(nèi)CX43分布最為廣泛。
　　 驚厥是大量神經(jīng)元超同步化放電所致，是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞的表現(xiàn)，或者是細(xì)胞興奮或抑制失衡所致。神經(jīng)元之間的離子產(chǎn)生的電活動在驚厥中起著不可忽視的作用，縫隙連接蛋白被認(rèn)為是神經(jīng)元間的電突觸的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。故此，通過縫隙

4、連接蛋白促使相鄰細(xì)胞形成同步化活動，造成放電的異常播散，有可能是形成癲癇的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。
　　 目前對FCD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識還很膚淺，關(guān)于FCD的國內(nèi)外臨床研究較多，多集中在對于手術(shù)切除標(biāo)本的回顧性研究，但較缺乏相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗研究，F(xiàn)CD的形成機(jī)制和致癇機(jī)制尚不明了，缺乏穩(wěn)定的可靠的動物模型。正確建立FCD動物模型對人類疾病病因病機(jī)分析，診斷方法探索，針對性的治療及預(yù)后判斷有著不可估量的意義。
　　 故此，本實驗擬采用液氮冷

5、凍方法探討制作FCDⅢd動物模型的可行性，并對CX43的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 目的:應(yīng)用液氮冷凍方法建立FCDⅢd的癲癇大鼠模型并驗證，分析CX43在模型中的表達(dá)，從而為進(jìn)一步探討人類FCD發(fā)生機(jī)制及未來治療提供理論及實驗依據(jù)。
　　 方法:取孕鼠產(chǎn)后第一天乳鼠為實驗對象，液氮冷凍新生乳鼠大腦皮層，隨機(jī)分為實驗組和對照組，實驗組依據(jù)冷凍時間不同分為30秒實驗組、60秒實驗組和90秒實驗組三個亞組。自造模后21天到第8周為

6、實驗時間，期間觀察實驗動物意識狀態(tài)、行為學(xué)，實驗第8周監(jiān)測發(fā)作間期腦電圖，實驗動物滿8周時行頭顱核磁共振檢查，行HE染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)及CX43的表達(dá)，最終實驗數(shù)據(jù)以SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。
　　 結(jié)果:各實驗組不同程度存在精神萎靡，活動減少，不思飲食等表現(xiàn)。行為學(xué)中自發(fā)性癲癇僅觀察到5次，表現(xiàn)為濕狗樣顫動，面肌抽動，咀嚼動作增多;節(jié)律性點頭，洗臉樣動作增多;最嚴(yán)重表現(xiàn)為前肢陣攣。實驗組腦電圖癲癇樣放

7、電率平均約為41.6％，各實驗組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗組MRI陽性結(jié)果表現(xiàn)為造模部位長T1長T2信號。實驗組腦組織切片HE染色見存在層狀結(jié)構(gòu)和存在柱狀結(jié)構(gòu)紊亂，存在形態(tài)異常神經(jīng)元和氣球細(xì)胞，F(xiàn)CDⅢd陽性率平均約為75％，60秒、90秒實驗組較30秒實驗組陽性率明顯增高P＜0.05，但60秒實驗組與90秒實驗組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。CX43每視野陽性細(xì)胞數(shù)（以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)）:對照組19.90±3.221，30秒實驗組45.24±3.1