NK細(xì)胞在胃癌中的應(yīng)答調(diào)控及作用研究.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和致死率位居世界前列。胃癌的發(fā)生發(fā)展受到胃癌微環(huán)境中各種細(xì)胞相互調(diào)控的影響,其中免疫抑制性微環(huán)境的形成與胃癌的進(jìn)展及病人的臨床預(yù)后不良密切相關(guān)。
　　在胃癌微環(huán)境中,除了腫瘤細(xì)胞和固有存在的間質(zhì)細(xì)胞,還包括遷移到腫瘤微環(huán)境中來(lái)的免疫細(xì)胞。研究表明活化的免疫細(xì)胞及其效應(yīng)分子在腫瘤組織中的增加通常預(yù)示著患者有較長(zhǎng)的生存時(shí)間,同時(shí)缺乏T、B和NK細(xì)胞的重組活化基因2和白介素2受體雙敲除(Rag2-/-

2、PIl2rg-/-)小鼠亦可自發(fā)形成腫瘤并很容易誘導(dǎo)肉瘤。因此,腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能很可能成為胃癌免疫治療的新策略。
　　目前認(rèn)為,CD8P+ P細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8P+ PCTL)介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫中占據(jù)主導(dǎo)地位,CD8+ PCTL在腫瘤微環(huán)境中的增加常提示患者預(yù)后良好。然而,課題組前期的研究顯示CD8+ CTL在胃癌微環(huán)境中受到一群由外周血趨化至腫瘤部位的髓

3、樣來(lái)源抑制性細(xì)胞的調(diào)節(jié),從而導(dǎo)致CD8P+ PCTL不能有效清除腫瘤細(xì)胞。近年來(lái),NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。NK細(xì)胞不僅能夠同CD8P+ PCTL一樣分泌顆粒酶、穿孔素和 IFN-γ作用于腫瘤細(xì)胞,而且可以直接靶向識(shí)別并以抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性途徑攻擊腫瘤細(xì)胞,促使腫瘤細(xì)胞裂解死亡。盡管如此,在對(duì)已形成腫瘤如肝癌等患者和小鼠誘導(dǎo)腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的功能隨腫瘤的進(jìn)程明顯受到抑制并與患者的臨床預(yù)后不良相關(guān)。

4、提示NK細(xì)胞功能的異常改變可能是導(dǎo)致腫瘤不斷惡化的重要原因。那么,在胃癌微環(huán)境中NK細(xì)胞的功能是否受到抑制尚不明確。
　　單核/巨噬細(xì)胞是一群浸潤(rùn)到腫瘤微環(huán)境中影響效應(yīng)性淋巴細(xì)胞抗腫瘤應(yīng)答的重要免疫細(xì)胞類型。目前認(rèn)為,腫瘤活化的單核細(xì)胞是一群具有免疫抑制性的巨噬細(xì)胞,其可通過(guò)分泌免疫抑制性的因子或上調(diào)表達(dá)免疫抑制性的配體作用于淋巴細(xì)胞,從而調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能。目前,在胃癌微環(huán)境中單核/巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)特性和功能仍存在爭(zhēng)議

5、,并且其在胃癌中是否能夠調(diào)控NK細(xì)胞的功能以及具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚。
　　【研究目的】
　　1.分析NK細(xì)胞在胃癌中的分布、受體表達(dá)及功能特征;
　　2.探討NK細(xì)胞在胃癌中的調(diào)控機(jī)制及其臨床意義。
　　【研究方法】
　　1. NK細(xì)胞在胃癌中的分布、受體表達(dá)和功能特征
　　從重慶西南醫(yī)院普外科收集了65例胃癌病人手術(shù)切除的組織標(biāo)本和外周血,30例健康人外周血作為正常對(duì)照。H&E染色確立胃組織標(biāo)本的

6、病理學(xué)特征。利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞的分布情況。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞表面受體和功能相關(guān)分子的表達(dá)情況。
　　2. NK細(xì)胞在胃癌中的調(diào)控機(jī)制
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌組織中單核/巨噬細(xì)胞的表型,免疫組織化學(xué)雙重染色分析單核/巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞的共定位情況。
　　購(gòu)買重慶西南醫(yī)院輸血科的正常人外周血,免疫磁珠分選外周血CD14陽(yáng)性的單核細(xì)胞。條件性外周血單核細(xì)胞由25％胃癌細(xì)胞系 AGS細(xì)胞、

7、胃癌組織和非腫瘤正常組織培養(yǎng)上清與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)12小時(shí)所得。
　　在共培養(yǎng)體系中,免疫磁珠分選純化外周血 NK細(xì)胞,再按照4:1的比例與同一個(gè)體的正?；驐l件性外周血單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),同時(shí)加入 rhIL-2。在上述條件下或?qū)K細(xì)胞預(yù)先孵育抗2B4抗體30 min,或直接加入抗TGF-β1抗體進(jìn)行共培養(yǎng),7天后收集細(xì)胞用于NK細(xì)胞表面分子染色,或加入PMA和離子霉素刺激以及Golgistop阻斷蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)4-6 h,而后收集

8、細(xì)胞流式染色檢測(cè)內(nèi)因子的表達(dá),7-AAD/annexinⅤ凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NK細(xì)胞的凋亡情況。此外,體外加入rhTGF-β1直接作用于NK細(xì)胞5天,收集細(xì)胞進(jìn)行流式染色檢測(cè)。
　　3. NK細(xì)胞對(duì)胃癌病人預(yù)后的影響
　　統(tǒng)計(jì)65例胃癌病人的臨床信息,根據(jù)國(guó)際腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床TNM分期,胃癌病人的總生存率從手術(shù)當(dāng)天算起,直到死亡或者最后一次隨訪。利用Mann Whitney非參檢驗(yàn)比較兩組間的差異,單因素方差分析比較多組

9、間的差異。Kaplan-Meier方法計(jì)算病人的累計(jì)生存時(shí)間, log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存率的差異。采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖形繪制,P<0.05可認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　【研究結(jié)果】
　　1. NK細(xì)胞在胃癌中的分布、受體表達(dá)及功能特征
　　1.1流式染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示:NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和T細(xì)胞在正常人外周血中的百分率分別為18.03%±1.82%、3.25%±0.38%和

10、52.47%±2.56%,在胃癌病人外周血中的百分率分別為18.00%±1.67%、2.92%±0.40%和53.00%±2.08%;在胃癌病人非腫瘤正常組織中的百分率分別為4.41%±0.38%、0.93%±0.14%和16.24%±2.03%,在癌旁組織中的百分率分別為3.55%±0.25%、1.06%±0.15%和22.27%±2.09%,在癌組織中的百分率分別為2.38%±0.17%、1.29%±0.19%和29.82%±2.0

11、2%。獨(dú)立T檢驗(yàn)比較顯示這三群細(xì)胞在正常人和胃癌病人外周血中的百分率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在外周血中的百分率均顯著高于組織標(biāo)本中的百分率。在組織標(biāo)本中,NK細(xì)胞在癌組織中的百分率顯著低于癌旁組織和非腫瘤正常組織;反之,T細(xì)胞在胃癌組織中的百分率則顯著高于癌旁組織和非腫瘤正常組織。進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞在胃癌組織中的浸潤(rùn)較癌旁組織和正常組織少。
　　1.2與正常外周血NK細(xì)胞相比,胃癌病人外周血NK細(xì)胞低表達(dá)活化型受體N

12、KG2D、NKp30和DNAM-1。而在胃癌病人組織中,與癌旁組織和正常組織中的NK細(xì)胞相比,胃癌組織浸潤(rùn)的NK細(xì)胞低表達(dá)CD16,而NKp44和2B4的表達(dá)則有所增加。但另外兩個(gè)自然殺傷受體NKp30、NKp46以及其他的活化型受體NKG2D、DNAM-1和CD94則無(wú)明顯改變。此外,抑制型受體NKG2A、CD158a/h、CD158b和CD158e1在各組織NK細(xì)胞中所占的百分率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　1.3與癌旁組織和正常組織

13、相比,胃癌組織浸潤(rùn)的NK細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞活化分子CD69,但與細(xì)胞增殖相關(guān)的分子Ki-67的百分率則明顯較低,同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)配體TRAIL和細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ的表達(dá)也顯著下降。盡管穿孔素在腫瘤組織中并無(wú)顯著變化,但是介導(dǎo)NK細(xì)胞脫顆粒的毒性功能分子CD107a在胃癌浸潤(rùn)的NK細(xì)胞中的表達(dá)卻顯著下降。
　　2. NK細(xì)胞在胃癌中的調(diào)控機(jī)制
　　2.1流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌浸潤(rùn)的CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞共表達(dá)CD68,且高表達(dá)共

14、刺激分子CD80,CD86和HLA-DR,同時(shí)上調(diào)表達(dá)CD16,Tie-2和CD163,提示其是一群被激活的具有免疫抑制性的巨噬細(xì)胞。相關(guān)性分析結(jié)果顯示胃癌浸潤(rùn)的單核細(xì)胞與NK細(xì)胞成負(fù)相關(guān)。在胃癌組織中,免疫組織化學(xué)雙重染色發(fā)現(xiàn) CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞存在相互接觸的現(xiàn)象。
　　2.2相比未經(jīng)處理的單核細(xì)胞,胃癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清作用后的條件性外周單核細(xì)胞能夠促進(jìn)NK細(xì)胞上調(diào)CD69分子的表達(dá),但同時(shí)也能下調(diào)增殖和效應(yīng)功能相關(guān)分

15、子Ki-67、Perforin、TRAIL以及抑制IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。NK細(xì)胞活性分析顯示兩組單核細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡的能力無(wú)差異。上述結(jié)果提示條件性單核細(xì)胞可促進(jìn)NK細(xì)胞的活化,但是顯著抑制了NK細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能。
　　2.3相比未經(jīng)處理的單核細(xì)胞,胃癌細(xì)胞系作用的條件性外周單核細(xì)胞并不上調(diào)CD48、PD-L1和PD-L2以及CD155和CD112分子的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌組織和正常組織中CD48、PD-L1和

16、PD-L2以及CD155和CD112在單核細(xì)胞的表達(dá)也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在外周NK細(xì)胞與胃癌細(xì)胞系作用的單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,預(yù)先孵育抗2B4抗體阻斷CD48/2B4信號(hào)不能有效逆轉(zhuǎn)單核細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的抑制。但加入抗TGF-β1抗體后則發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的功能得以恢復(fù)。此外,利用胃癌組織培養(yǎng)上清作用的單核細(xì)胞也能夠顯著抑制NK細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和TNF-α,加入抗TGF-β1抗體后則能夠恢復(fù)NK細(xì)胞的功能。進(jìn)一步體外直接加入rhTGF-β1可導(dǎo)致

17、NK細(xì)胞下調(diào)Ki-67和IFN-γ的表達(dá)。上述結(jié)果表明TGF-β1信號(hào)在腫瘤活化的單核細(xì)胞抑制NK細(xì)胞的功能中發(fā)揮了重要作用。
　　3. NK細(xì)胞對(duì)胃癌病人預(yù)后的影響
　　胃癌組織大于5cm或腫瘤侵襲晚期的病人腫瘤中NK細(xì)胞的百分率顯著低于胃癌組織小于5cm或腫瘤侵襲早期的病人,有神經(jīng)侵襲、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的病人腫瘤中NK細(xì)胞的百分率顯著低于沒(méi)有神經(jīng)侵襲和淋巴結(jié)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的病人。進(jìn)一步TNM分期顯示胃癌病人癌組織、癌旁組織和

18、非腫瘤正常組織中NK細(xì)胞的百分率隨胃癌的進(jìn)展均逐漸下降,但癌組織中的NK細(xì)胞百分率與胃癌的進(jìn)展成顯著負(fù)相關(guān)。根據(jù)胃癌組織中NK細(xì)胞百分率的中位數(shù)(2.36%)將病人分為高、低兩組,隨訪時(shí)間為20個(gè)月。通過(guò)對(duì)病人的生存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)高NK細(xì)胞百分率的病人組生存率顯著高于低NK細(xì)胞百分率的病人組。
　　【結(jié)論】
　　1.與T細(xì)胞在胃癌中浸潤(rùn)增加相反,腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞的百分率顯著低于癌旁組織和正常組織。盡管NK細(xì)胞表面的活化型受