Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病和家庭性腺瘤樣息肉病的致病基因突變分析.pdf

1、目的：
　　 Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病(Vitamin D-dependent rickets typeⅠ，VDDRⅠ)是一種以低鈣血癥、尿磷增多、骨骼損害為特征的常染色體隱性遺傳病。該病是一種少有的非營養(yǎng)性佝僂病，國內(nèi)罕見報道，目前尚無流行病學(xué)資料。該病主要是由于CYP27B1基因突變導(dǎo)致在腎小管上皮細胞中合成1，25(OH)2D3的25(OH)D3-1α羥化酶活性降低，生成1，25(OH)2D3減少所致。人類CYP27B1基

2、因定位于染色體12q13.1-13.3，全長4859bp，包含9個外顯子，編碼25(OH)D3-1α羥化酶，到目前為止已經(jīng)確定了38個與Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病相關(guān)的CYP27B1基因突變。本文通過對家系中一例Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者進行CYP27B1基因的突變分析檢測致病基因序列的改變，同時輔助臨床診斷和提供遺傳咨詢并有望豐富該基因的突變數(shù)據(jù)庫。
　　 家族性腺瘤性息肉病(Family adenomatous polypo

3、sis，F(xiàn)AP)是一種以多發(fā)性腺瘤樣息肉為主要特征的常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率為1/17000至1/5000，癌變率很高。目前普遍認為家族性腺瘤樣息肉病的發(fā)生與結(jié)腸腺瘤性息肉病基因APC(adenomatous polyposis coli)突變有著直接關(guān)系。研究證明APC基因是一種抑癌基因，定位于5q21-22，編碼區(qū)全長8538bp，包含15個外顯子，其中第15外顯子全長6577bp，是目前已知最大的人類外顯子。APC基因編碼APC

4、蛋白，包含2843個氨基酸，分子量約為310kD。APC基因的主要突變類型為點突變。大部分APC基因突變都會造成終止密碼子提前形成，導(dǎo)致蛋白截短，從而使其作為抑癌基因的作用喪失?，F(xiàn)在認為，截短蛋白的形成與腺瘤的惡變有關(guān)，也有研究指出APC基因的雜合丟失與癌的形成有關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對家族性腺瘤性息肉病的病因和APC基因逐步深入的了解，基因篩選診斷給我們提供了一種更先進的診斷技術(shù)。
　　 材料與方法：
　　

5、一、實驗材料
　　 收集到Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病家系共3人和兩個家族性腺瘤樣息肉病家系共8人，分別由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院和中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院提供外周血樣及相關(guān)病例資料。所有受檢成員以前均未接受過任何遺傳學(xué)檢測。
　　 二、方法
　　 （一）提取基因組DNA
　　 采用常規(guī)酚-氯仿方法或Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa, Japan)提?、裥?/p>

6、維生素D依賴性佝僂病家系成員、家族性腺瘤樣息肉病家系成員及80名正常人對照外周血基因組DNA。
　　 （二）PCR-DNA測序和克隆測序檢測CYP27B1基因和APC基因突變
　　 針對CYP27B1基因和APC基因的外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界處設(shè)計擴增引物，擴增CYP27B1基因和APC基因全部編碼序列。對PCR產(chǎn)物進行DNA純化回收，采用Beckman CEQ-8000遺傳分析儀或ABI PRISM3700自動測序儀

7、進行測序分析，檢測是否存在基因編碼區(qū)突變。針對CYP27B1基因檢出的雜合突變利用克隆測序驗證。
　　 （三）PCR-RFLP檢測
　　 針對測序檢測到的CYP27B1和APC基因序列改變，分別設(shè)計錯配引物引入PvuⅠ和XbaⅠ酶切位點，選取80名正常對照個體，利用錯配引物分別擴增患者和正常對照個體的基因組DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切和PAGE(Polyacrylamide gelelectrophoresis)檢測驗證。<

8、br>　　 結(jié)果：
　　 一、Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者CYP27B1基因突變分析結(jié)果
　　 PCR-DNA測序在Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者CYP27B1基因中檢測到兩處雜合突變c.311-321delGGCCCGAGCGC(p.R104LfsX225)和c.473T＞C(p.L158P)，通過對其正常表型的父母相同位點測序證實為復(fù)合雜合突變，針對患者和正常人的PCR-RFLP(Restriction fragme

9、nt length polymorphism)檢測結(jié)果顯示80名正常對照個體未出現(xiàn)與患者相同位點的變異，排除了其為SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)位點的可能性。
　　 二、家族性腺瘤樣息肉病家系A(chǔ)PC基因突變分析結(jié)果
　　 APC基因直接測序分別在兩個家系中檢出雜合突變，c.1766T＞A(p.K589X)和c.3180-3184delAAAAC(p.110601fsX3)，突變位

10、點分別位于第14和第15外顯子，兩處突變均導(dǎo)致提前形成的終止密碼子。通過PCR-RFLP分析在80名正常對照個體中沒有發(fā)現(xiàn)相同位點的改變。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用PCR-DNA測序檢測出Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者CYP27B1基因兩處雜合突變c.311-321delGGCCCGAGCGC(p.R104LfsX225)和c.473T＞C(p.L158P)，經(jīng)PCR-RFLP驗證和相關(guān)數(shù)據(jù)庫比對證實為CYP27B1基