P2X4受體拮抗劑的設計、篩選及其評價研究.pdf

1、神經病理性痛的治療一直是困擾臨床工作者的一大難題。目前的治療藥物主要有抗抑郁藥、抗癲癇藥、局麻藥、阿片類、非類固醇類消炎藥等，這些藥物的療效通常不令人滿意且?guī)磔^多的副作用。因此，開發(fā)療效確切且副作用較少的預防及治療神經病理性痛的藥物具有重要意義。近年來，國內外學者在該領域也進行了大量研究，從多角度來闡明神經病理性痛的發(fā)病機制，并試圖從多個靶點來研發(fā)相應的治療藥物。大量實驗結果顯示，膠質細胞在神經病理性痛發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。迄今為

2、止，在很多神經病理性痛模型中都觀察到神經膠質細胞表型以及功能的改變，其主要發(fā)生在脊髓中，同時也可以在其他高級腦區(qū)甚至外周神經系統(tǒng)中觀察到該現(xiàn)象。研究表明，抑制神經膠質細胞及其所表達的分子，可以對神經病理性痛起到預防或治療作用，這提示神經膠質細胞可能在神經病理性痛發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。
　　研究顯示，神經損傷會誘導小膠質細胞活化，使活化的小膠質細胞中P2X4受體表達量增加，推測P2X4受體與神經病理性痛有著緊密聯(lián)系。Tsuda

3、等[1]發(fā)現(xiàn)當神經損傷發(fā)生后，大鼠機械痛痛閾逐漸降低，同時其損傷側脊髓背角P2X4受體的表達量逐漸升高;免疫組化實驗證明，P2X4受體在小膠質細胞中表達較高。此后在大鼠自身免疫性神經炎模型[2]、大鼠慢性結扎損傷眶下神經模型[3]及大鼠福爾馬林炎性痛模型[4]上，研究者們發(fā)現(xiàn)模型動物在出現(xiàn)機械痛痛閾逐漸降低的同時，P2X4受體表達量逐漸增加。以上研究提示P2X4受體在神經病理性痛的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用。
　　Tsuda等

4、[1]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷誘導大鼠機械痛閾降低的同時，小膠質細胞活化，而鞘內給予P2X受體拮抗劑TNP-ATP(P2X受體P2X1-4受體亞型拮抗劑[22])能夠使這一現(xiàn)象得到改善，而P2X受體的另一拮抗劑PPADS(P2X受體P2X1-3，5，7受體亞型拮抗劑[22])則對此無作用。鞘內注射ATP活化的小膠質細胞能夠誘發(fā)大鼠機械痛痛閾降低，進一步鞘內注射TNP-ATP后，能夠逆轉活化的小膠質細胞誘發(fā)的痛閾降低，而注射PPADS后大鼠機械痛痛閾

5、無明顯變化。由于TNP-ATP是P2X4受體非選擇性拮抗劑，而PPADS對P2X4受體幾乎無效，提示TNP-ATP的藥理學作用可能與P2X4受體相關。于脊髓損傷模型大鼠鞘內給予P2X4受體反義寡聚核苷酸，使脊髓小膠質細胞中P2X4受體表達量降低的同時也顯著降低了了大鼠痛敏程度。通過P2X4受體基因敲除小鼠進行的一系列實驗，證實了其在神經病理痛發(fā)生過程中的作用[5]。
　　上述資料顯示，若能靶向抑制P2X4受體的作用，則可能對神經病

6、理性痛起到一定的緩解和治療作用。因此，本課題研究如下:
　　研究目的:以P2X4受體及現(xiàn)有P2X4受體拮抗劑為基礎，通過計算機輔助藥物設計及傳統(tǒng)的藥物設計，設計新的P2X4受體拮抗劑，并從中篩選出活性化合物，進一步評價其時效及量效關系。
　　研究方法:
　　1.建立大鼠CFA、SNI及小鼠SNI神經病理性痛模型，在造模成功后的不同時間點，對模型動物的手術側及對側丘腦、杏仁核、下丘腦、延髓、脊髓和紋狀體等部位進行取材，通

7、過qRT-PCR及蛋白免疫印跡實驗檢測P2X4受體和BDNF的變化。
　　2.以zfP2X4受體的晶體結構對hP2X4受體進行同源模建，基于受體和現(xiàn)有配體進行P2X4受體拮抗劑的設計。基于受體的藥物設計，利用模建好的晶體結構找到可能的與配體結合的活性位點進行化合物的虛擬篩選;基于配體的藥物設計，根據P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP建立藥效團模型，篩選化合物。應用傳統(tǒng)的藥物設計，根據論著及專利中報道的P2X4受體拮抗劑進行骨

8、架躍遷，找到化合物新骨架，得到改造后的化合物。在計算機水平對設計的化合物篩選后，進一步進行細胞水平及整體動物水平的篩選。
　　3.SNI模型小鼠初步篩選有鎮(zhèn)痛效果的化合物;建立HEK293-pEGFP-N1-rP2X4穩(wěn)轉細胞系，應用膜片鉗技術在建立好的細胞系上對動物水平篩選出的化合物進行驗證。對動物及細胞水平均有活性的化合物進行初步評價。
　　研究結果:
　　1.CFA模型大鼠在造模8h時，丘腦、脊髓及背根神經節(jié)中P

9、2X4受體mRNA水平明顯升高，其下游信號分子BDNF的mRNA表達量在脊髓中明顯上調;SNI模型大鼠在造模4天時，手術對側杏仁核中P2X4受體蛋白表達量明顯增加。造模7天時，紋狀體、杏仁核及手術對側下丘腦中P2X4受體蛋白表達量明顯增加;SNI模型小鼠在造模4天時，手術側杏仁核及丘腦中P2X4受體mRNA水平升高。造模7天時，手術側杏仁核中P2X4受體mRNA水平升高。這些結果提示P2X4受體的表達與神經病理性痛關系密切。
　　

10、2.基于受體的藥物設計，根據資料分析，找到P2X4受體3個活性位點，并基于這3個位點進行虛擬篩選，篩選出600個化合物;基于配體的藥物設計，根據TNP-ATP的結構建立藥效團模型進行虛擬篩選，并根據現(xiàn)有P2X4受體拮抗劑應用傳統(tǒng)的藥物設計進行骨架躍遷，共設計出3933個化合物。
　　3.通過可視化篩選分別對基于受體及配體設計的化合物篩選出96及114個化合物，首批從中選出24個化合物進行合成。
　　4.在小鼠SNI模型上，對

11、P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP進行確證和初步篩選。P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP在給藥后30 min、60 min及120 min小鼠機械痛閾值由0.09±0.11 g升高至0.91±0.7 g、0.92±0.46g及0.93±0.59 g;化合物L-01-01在給藥后60min小鼠機械痛閾值由0.15±0.09 g升高至1.14±0.90g;化合物L-01-02在給藥后60 min及120 min小鼠機械痛閾值由0

12、.12±0.11 g升高至0.43±-0.49 g及0.45±0.30 g;化合物L-01-10在給藥后120 min小鼠機械痛閾值由0.22±0.21 g升高至0.55±0.22 g;化合物L-01-21在給藥后30min小鼠機械痛閾值由0.04±0.03g升高至0.34±0.23 g;化合物L-01-22在給藥后90min小鼠機械痛閾值由0.03±0.02 g升高至0.88±1.41 g。
　　5.建立HEK293-pEGFP

13、-N1-rP2X4穩(wěn)轉細胞系，從基因及蛋白水平證明了細胞系rP2X4受體過表達，應用膜片鉗技術證明細胞系功能完整;在該細胞系上，應用膜片鉗技術對P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP進行確證并對首批選出的化合物進行初步篩選。P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP及化合物L-01-01幾乎完全阻斷P2X4受體ATP激活電流，L-01-05能夠阻斷P2X4受體ATP激活電流，抑制率為41.90±3.85％。
　　6.化合物L-01

14、-01對小鼠自發(fā)活動的影響，地西泮在給藥10min、30min及60 min后小鼠運動距離明顯減少;P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP在給藥10min及60 min后小鼠運動距離明顯減少;化合物L-01-01在給藥60 min后小鼠運動距離明顯減少。
　　結論:P2X4受體與神經病理性痛關系密切;通過計算機模擬，基于受體及配體共設計P2X4受體拮抗劑3933個;經可視化篩選獲得P2X4拮抗劑24個，其中5個表現(xiàn)出抗神經病理性