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1、目的:利用虛擬篩選結(jié)合活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)全新結(jié)構(gòu)且具有較高活性和選擇性的A2A受體小分子拮抗劑,并初步探討拮抗劑在大鼠僵住癥模型上的效果。
方法:培養(yǎng)A2A受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞,收集細(xì)胞后勻漿裂解,低速離心去除核及未裂解的細(xì)胞,超高速離心收集細(xì)胞質(zhì)膜成分,測(cè)定濃度后取50~70μg/管采用放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)法測(cè)定;同樣,培養(yǎng)A1受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞,同法收集細(xì)胞質(zhì)膜成分,測(cè)定濃度后取30~50μg/管測(cè)定;篩選
2、時(shí),先用100μM化合物初篩,初篩使用兩副孔,重復(fù)一次。初篩后選擇抑制率大于80%的化合物進(jìn)行復(fù)篩,復(fù)篩做化合物濃度-特異性結(jié)合曲線,化合物濃度范圍為100μM~1nM/0.1nM,每濃度使用兩副孔,從曲線中通過GraphPad Prism計(jì)算得到Ki及IC50,重復(fù)一次。通過放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選,確認(rèn)對(duì)A2A具有親和力,且相對(duì)于A1而言有選擇性的化合物,進(jìn)行細(xì)胞的功能性評(píng)價(jià)。功能性評(píng)價(jià)選用離心收集的A2A-HEK-293活細(xì)胞,將終
3、濃度范圍為100μM~1 nM/0.1 nM的化合物,加入激動(dòng)劑預(yù)先處理的平衡緩沖液混懸的細(xì)胞中,通過測(cè)定cAMP來(lái)確證其拮抗活性。最后,優(yōu)選活性較好的A2A受體小分子拮抗劑進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),使用氟哌啶醇誘導(dǎo)的僵直大鼠來(lái)進(jìn)行小分子拮抗劑的體內(nèi)抗PD作用的研究。
結(jié)果:在第一批次篩選的化合物中,選取兩個(gè)Ki小于1μM的化合物進(jìn)行功能及抗PD活性測(cè)定,證明其A2A受體拮抗活性及抗PD活性良好;在此基礎(chǔ)上,再選取這兩個(gè)化合物的32個(gè)
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