CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16、CX-,3-CL1在正常人和肝纖維化與肝硬化患者肝臟組織內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、背景和目的：
　　 由乙型肝炎病毒等因?yàn)橐鸬慕K末期肝病嚴(yán)重威脅著人類的健康,損傷的肝臟細(xì)胞無法發(fā)揮正常功能,肝臟移植是目前最為有效的治療手段,但在臨床工作中,肝臟移植的廣泛運(yùn)用受到供體來源匱乏等因素的限制。尋找一種能夠替代肝臟移植的治療方法,讓被破壞的肝臟細(xì)胞得以自行修復(fù)和再生,恢復(fù)其正常功能,一直是肝病學(xué)家的夢想。
　　 肝臟再生的確切機(jī)制至今尚未明確,研究的重點(diǎn)在于找到啟動(dòng)和調(diào)節(jié)再生的因素。這種因素可能是一些化學(xué)物

2、質(zhì)或生物因子,引起或促進(jìn)殘留肝細(xì)胞的分裂增殖；也可能是肝細(xì)胞的破壞減少導(dǎo)致正常存在的某些抑制因子濃度下降而啟動(dòng)肝臟細(xì)胞分裂。
　　 近年來,應(yīng)用骨髓源性肝干細(xì)胞(bone marrow derived liver stem cell,BMDLSC)治療終末期肝病是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn),而且顯示出一定的應(yīng)用前景。BMDLSC可以恢復(fù)因病變而減少的肝細(xì)胞數(shù)量,修復(fù)因病變而破壞了的肝組織結(jié)構(gòu),使肝臟再生。
　　 BMDLSC在

3、生理狀態(tài)下定居在骨髓,它向肝內(nèi)歸巢的機(jī)制不明確。從理論上講,應(yīng)該與白細(xì)胞向炎性病灶聚集的機(jī)制有相似之處。也就是說,在BMDLSC向肝內(nèi)歸巢的過程中,趨化因子及其受體系統(tǒng)應(yīng)該起著重要作用。
　　 迄今發(fā)現(xiàn)的的趨化因子,根據(jù)其N端半胱氨酸殘基的位置和數(shù)目可分為4個(gè)亞族:C-、CC-、CXC-和CX3C-。其中,CXC類趨化因子亞家族包括CXCL1-CXCL16共16個(gè)成員,CX3C類趨化因子亞家族只有一個(gè)成員Fractalkine,

4、系統(tǒng)命名為CX3CL1。國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究證明,部分趨化因子及其受體系統(tǒng)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC)的定向遷移過程中起作用。目前研究的最多的是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1),它是一種可趨化CXCR4陽性的BMMSC的因子。SDF-1/CXCR4相互作用參與干細(xì)胞的遷移和向肝細(xì)胞分化的過程。但是,關(guān)于其

5、他趨化因子在肝臟疾病進(jìn)程中的作用,特別是趨化BMMSC遷移至肝臟修復(fù)損傷的研究報(bào)道卻非常少。綜觀已有的文獻(xiàn)資料,CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine等趨化因子的作用也值得重視,因?yàn)樵隗w外實(shí)驗(yàn)中,這些趨化因子都可以驅(qū)使BMMSC向濃度遞增方向遷移。但在人體內(nèi),這些趨化因子在肝組織中有無表達(dá)、在不同病理狀態(tài)下的表達(dá)有何變化、在BMDLSC遷移至肝臟修復(fù)損傷過程中起何作用都不清楚,目前也無這方面的報(bào)道。本

6、研究對(duì)趨化因子CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine在正常肝組織和肝纖維化與肝硬化組織中的含量進(jìn)行了觀察,從一個(gè)新的角度對(duì)這些趨化因子促使BMDLSC遷移至肝臟修復(fù)損傷的作用提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.研究對(duì)象
　　 人肝臟組織,樣本量為30例,男性17例,女性13例。年齡19～77(平均50)歲。標(biāo)本均來自2008年05月～2009年05月在南方醫(yī)科大學(xué)南方

7、醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)(包括肝移植)的患者。肝組織標(biāo)本在手術(shù)中獲取,肝組織切取后立即分為兩份,一份甲醛固定后行組織病理學(xué)檢查,另一部分放入1.5 mL EP管內(nèi)置于-80℃低溫冰箱保存待測。
　　 2.標(biāo)本分組
　　 ①正常對(duì)照組(n=9):患者無乙型肝炎病史,乙型肝炎兩對(duì)半顯示乙型肝炎表面抗原陰性,肝組織病理學(xué)檢查顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常。
　　 ②肝纖維化組(n=10):患者有乙型肝炎病史或乙型肝炎病毒感染史,乙型肝

8、炎兩對(duì)半顯示乙型肝炎表面抗原陽性,組織病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)纖維組織廣泛增生,但未見假小葉形成。
　　 ③肝硬化組(n=11):患者有乙型肝炎病史或乙型肝炎病毒感染史,乙型肝炎兩對(duì)半顯示乙型肝炎表面抗原陽性,肝組織病理學(xué)檢查提示肝內(nèi)纖維組織廣泛增生,并有假小葉形成。
　　 3.觀察指標(biāo)
　　 3.1臨床癥狀與體征
　　 詢問病史和體格檢查以確認(rèn)患者有無黃疸,有無肝掌與癡蛛痣,有無腹腔積液,有無肝性腦病等,以及

9、這些癥狀體征的程度。
　　 3.2影像學(xué)檢查
　　 行肝臟腹腔B型超聲檢查和肝臟CT掃描。
　　 3.3實(shí)驗(yàn)室檢查
　　 行乙肝兩對(duì)半、丙肝抗體試驗(yàn)；手術(shù)當(dāng)天抽血化驗(yàn)查肝功能指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)、凝血酶原時(shí)間(PT)。
　　 3.4組織病理學(xué)檢查
　　 肝組織經(jīng)固定,常規(guī)石蠟包埋與切片,HE染色后,光學(xué)顯

10、微鏡下觀察。
　　 4.肝組織中趨化因子CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine含量的測定
　　 4.1肝組織的勻漿、離心
　　 肝組織經(jīng)電子天平稱重后移入微量手動(dòng)玻璃勻漿器中于冰水中勻漿5min,然后按1/8質(zhì)量體積比加入1xPBS緩沖液將勻漿組織洗下并轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中,再稀釋一倍后,低溫高速離心機(jī)4℃下1000xg離心10min,提取上清液移至另一1.5ml EP管

11、中,低溫高速離心機(jī)4℃下25000r/min離心20min,取上清液分別測定CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine濃度。
　　 4.2 ELISA法測定趨化因子的含量
　　 采用雙抗體夾心ELISA法,已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將趨化因子和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A

12、、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用,產(chǎn)生顏色。在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與其OD值,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合,得到擬合效果最佳的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,最后計(jì)算出標(biāo)本離心液中的趨化因子的濃度。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。行x列表資料采用x2檢驗(yàn)；多組均數(shù)方差齊性,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較；多

13、組均數(shù)方差不齊,采用Welch近似方差分析及Dunnett’s T3兩兩比較。相關(guān)分析數(shù)據(jù)符合雙變量正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示,不符合雙變量正態(tài)分布的采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。統(tǒng)計(jì)分析中,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)論
　　 1.趨化因子CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine在正常肝組織中有表達(dá)。
　　 2.肝臟發(fā)生纖維化損傷時(shí),肝組織中CXCL5、C

14、XCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine的表達(dá)數(shù)量增多,但它們的變化規(guī)律不同。肝內(nèi)CXCL5、CXCL13水平在肝纖維化階段開始升高,至肝硬化階段升高到顯著水平。肝內(nèi)CXCL8、CXCL16、Fractalkine水平在肝纖維化階段就已經(jīng)升高到顯著水平,至肝硬化階段仍維持在高水平狀態(tài)。提示CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine在肝病損傷誘發(fā)的BMMSC向肝臟遷移方面很可能有所作用,