日本血吸蟲高遷移率族蛋白活化小鼠巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能研究.pdf

1、血吸蟲病廣泛流行于非洲、亞洲和南美，是僅次于瘧疾的一種寄生蟲病。血吸蟲病的長期防控依賴于高效疫苗的應(yīng)用。目前國際上公認(rèn)的具有較高保護(hù)力效果的疫苗是輻照致弱的尾蚴/童蟲疫苗(RAV)，但由于材料來源困難、安全性等問題，不能大規(guī)模使用。因此，需要通過研究RAV模型的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制來研發(fā)出高效、安全的抗血吸蟲分子疫苗。
　　研究發(fā)現(xiàn)RAV模型可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平的以Th1為優(yōu)勢應(yīng)答的高保護(hù)力，其原因可能是輻照后蟲體損傷嚴(yán)重，移行緩慢，

2、長期滯留在肺部并伴隨大量蟲源性分子的釋放，引起宿主較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。高遷移率族蛋白(HMGB1)是一種核蛋白，在電離輻射條件下可從核內(nèi)遷移至胞外。已有研究表明曼氏血吸蟲HMGB1可誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞釋放大量的致炎細(xì)胞因子，是引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。因此推測日本血吸蟲HMGB1(SjHMGB1)作為蟲源性的應(yīng)激分子在RAV誘導(dǎo)的高保護(hù)力中發(fā)揮了類似的重要作用。本研究旨在探索SjHMGB1在活化宿主免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)上的功能。為進(jìn)一步闡

3、明SjHMGB1在RAV中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。
　　1、分析SjHMGB1在輻照與正常蟲體細(xì)胞上的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)不同期別的輻照和正常童蟲，用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示SjHMGB1在輻照早期4d時(shí)的表達(dá)量明顯高于正常組，7d時(shí)顯著下降低于正常組(P＜0.01)，10d、14d兩者無顯著差異;RT-PCR檢測SjHMGB1的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)輻照組在4d、7d顯著高于正常組(P＜0.01)，在10d時(shí)兩組無顯

4、著差異。初步推斷SjHMGB1在輻照童蟲早期大量表達(dá)釋放。
　　2、分析reSjHMGB1誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。reSjHMGB1蛋白刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞48h后，MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群狀況以及胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示該蛋白能夠顯著的刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞增殖(SI＞2);蛋白免疫組CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值為2.28顯著高于對(duì)照組的1.76(P＜0.01)，且胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)量顯

5、著增加(P＜0.01)。提示SjHMGB1蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。
　　3、分析reSjHMGB1在調(diào)節(jié)宿主固有免疫中的作用。reSjHMGB1與RAW264.7細(xì)胞共孵育48h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子、ELISA檢測胞外細(xì)胞因子。結(jié)果表明reSjHMGB1刺激組與對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞表面Toll受體4(TLR4)受體上調(diào)表達(dá)，差異極顯著(P＜0.01)，而Toll受體2(TLR2)受體下調(diào)表達(dá)(P

6、＜0.05)，同時(shí)胞外TNF-α和NO的分泌量顯著增加(P＜0.01)。提示SjHMGB1可通過TLR4通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向致炎性的M1型巨噬細(xì)胞分化。
　　4、研究reSjHMGB1誘導(dǎo)宿主樹突狀細(xì)胞(DC)功能成熟。reSjHMGB1刺激分選后的DC48h后再與CD4+T細(xì)胞共孵育168h，流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面分子、胞內(nèi)細(xì)胞因子和T細(xì)胞增殖情況，ELISA檢測胞外細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果表明reSjHMGB1刺激組DC細(xì)胞表面的

7、趨化因子受體CCR7和CXCR4顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.01)，同時(shí)胞外TNF-α，IFN-γ，IL-4的含量顯著增加(P＜0.01)。reSjHMGB1蛋白與DC和CD4+T共孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD4+T釋放IFN-γ顯著增加(P＜0.01)。提示SjHMGB1促進(jìn)DC功能成熟，活化CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。
　　5、初步探索reSjHMGB1活化嗜中性粒細(xì)胞的功能。蛋白刺激嗜中性粒細(xì)胞4h后，通過顯微鏡觀察嗜中性粒細(xì)

8、胞胞外陷阱(NETs)的形成，RT-PCR檢測細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白刺激后可觀察到明顯的NETs現(xiàn)象，且與對(duì)照組相比MMP-9，MCP-1，CCL-3和CXCL-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高(P＜0.01)。提示SjHMGB1能夠刺激嗜中性粒細(xì)胞向炎癥表型分化。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SjHMGB1在輻照童蟲早期大量表達(dá)及釋放，能夠活化巨噬細(xì)胞、促進(jìn)DC功能成熟、活化CD4+T細(xì)胞并誘導(dǎo)其向Th1型分化。初