日本血吸蟲(chóng)鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白免疫生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、研究表明，輻照致弱血吸蟲(chóng)疫苗能夠誘生高保護(hù)性免疫效果，其機(jī)制可能是通過(guò)輻照致弱血吸蟲(chóng)來(lái)源的分子刺激宿主免疫細(xì)胞在肺部形成了以Th1為主的致炎性環(huán)境而實(shí)現(xiàn)的。因此，發(fā)現(xiàn)和鑒定這些保護(hù)性分子并闡明其免疫生物學(xué)功能，對(duì)研發(fā)高效安全的抗血吸蟲(chóng)分子疫苗具有重要的指導(dǎo)意義。
　　本文旨在研究日本血吸蟲(chóng)鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白(SchistosomajaponicumCalreticulin,SjCRT)在先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中的作用和功能，以期為

2、闡明輻照致弱血吸蟲(chóng)疫苗的保護(hù)機(jī)制提供依據(jù)。
　　1、SjCRT在不同期別正常及輻照致弱童蟲(chóng)上的表達(dá)。體外培養(yǎng)不同期別的輻照和正常童蟲(chóng)，用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)4 d時(shí)SjCRT在輻照組蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)；而7 d、10 d和14 d時(shí)，SjCRT在輻照組蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯低于正常組(P<0.05)。RT-PCR檢測(cè)SjCRT轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)輻照組在7 d顯著高于正常

3、組(P<0.05)，在10 d時(shí)兩組無(wú)顯著差異。初步推斷在輻照早期4 d時(shí)SjCRT在蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間推移，SjCRT釋放到細(xì)胞外。
　　2、SjCRT活化宿主巨噬細(xì)胞的初步研究。SjCRT與RAW264.7細(xì)胞共孵育72 h，通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、Griess法檢測(cè)胞外 NO含量、RT-PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)、ELISA檢測(cè)胞外細(xì)胞因子、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子。

4、MTT結(jié)果顯示，SjCRT能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示SjCRT促進(jìn)巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α和IL-1βmRNA；Griess法結(jié)果提示，SjCRT能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO(P<0.01)；ELISA結(jié)果表明SjCRT能夠極其顯著地促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)表明，未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞能表達(dá)一定水平的CCR7，但SjCRT的刺激能使巨噬細(xì)胞表面

5、趨化因子受體CCR7的表達(dá)水平極顯著地增加(P<0.05)。提示SjCRT可以活化巨噬細(xì)胞。
　　3、探究SjCRT活化宿主DC的機(jī)制。通過(guò)激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)研究SjCRT與DC的結(jié)合情況、RT-PCR檢測(cè)DC上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況、ELISA檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá)情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CCR7和CXCR4表達(dá)情況、CFSE法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞增殖、ELISA檢測(cè)CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子分泌

6、情況。結(jié)果：SjCRT可以結(jié)合在DC表面，它能夠與DC表面的CD91受體結(jié)合進(jìn)而被介導(dǎo)內(nèi)吞；RT-PCR結(jié)果顯示與未刺激相比， SjCRT的刺激可以促進(jìn) DC極其顯著地上調(diào) TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、CXCL-2、CCR7和CXCR4這幾種細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA的表達(dá)(P<0.01)；SjCRT的刺激也能促進(jìn)DC極其顯著的表達(dá)并分泌TNF-α、IFN-γ和IL-4，并且差異極其顯著(P<0.01)；流式結(jié)果顯示

7、SjCRT的刺激能使細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7和CXCR4的表達(dá)水平極顯著地增加(P<0.01)；CFSE法表明SjCRT刺激組有明顯的增殖現(xiàn)象，增殖細(xì)胞百分比分別為47.7％和44.1%；ELISA檢測(cè)CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子分泌情況，顯示SjCRT刺激48h后的DC能夠促進(jìn)T細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10，并且與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果提示：SjCRT能夠促進(jìn)DC功能成熟。
　　4、

8、SjCRT誘導(dǎo)致敏小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。SjCRT刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群狀況以及胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示該蛋白能夠顯著地刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞增殖(SI>2)；蛋白免疫組CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值為2.26顯著高于對(duì)照組的1.76(P<0.01)，且胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。提示SjCRT可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　綜上所