多發(fā)性骨髓瘤微泡抑制MSCs成骨分化及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:微泡:MM細(xì)胞與MSCs信息交流的新信使
　　目的:觀察MM-MV形態(tài)、免疫表型;探討分離MSCs方法;證實(shí)MV與MSCs相互作用。方法:應(yīng)用透射電鏡觀察MV大小、形態(tài);流式細(xì)胞儀檢測(cè)MV免疫表型特征。采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)MSCs,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及免疫表型。激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀證實(shí)MM-MV與MSC作用。
　　結(jié)果:MV表達(dá)母體細(xì)胞表面標(biāo)志CD138,電鏡下見(jiàn)大小不一,

2、0.3～1μm之間的囊泡結(jié)構(gòu)。傳代后的MSCs形態(tài)均一,呈成纖維細(xì)胞樣;第三代MSCs CD90、CD13、CD105、CD44陽(yáng)性,CD34、CD45、CD14陰性;96.47％細(xì)胞處于G0/G1期。MSCs在2h內(nèi)即攝取、內(nèi)化MM-MV;MV傳遞CD138,MSCs表型部分轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論:MM細(xì)胞釋放CD138陽(yáng)性MV;全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)MSCs簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效;MV為MM細(xì)胞與MSCs新作用途徑。
　　第二部分

3、:MM-MV對(duì)MSCs成骨分化的效應(yīng)
　　目的:探討MM-MV對(duì)MSCs成骨分化作用。
　　方法:ALP、茜素紅染色觀察CFU-Fs、CFU-OB;MTT法檢測(cè)MV與MSCs共培養(yǎng)24-72h對(duì)MSCs增殖影響;FCM檢測(cè)MV與MSCs共培養(yǎng)兩周對(duì)細(xì)胞凋亡影響;Quantitative real time RT-PCR檢測(cè)共培養(yǎng)d3、d6 RUNX2及骨標(biāo)志基因ALP、osteocalcin、collagenⅠmRNA表達(dá);

4、ElISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中骨鈣蛋白水平;ALP活性試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中ALP活性。
　　結(jié)果:①8226、U266上清、條件上清抑制CFU-F形成,但條件上清的抑制作用弱于上清(P<0.05);KM3上清抑制CFU-F形成,而KM3條件上清無(wú)抑制作用(P<0.05、P>0.05);KM3上清抑制CFU-OB形成,條件上清對(duì)CFU-OB無(wú)抑制作用(P<0.01、P>0.05)。②50-100ng/mlMM-MV對(duì)MSCs無(wú)增殖、凋亡

5、作用。③8226、U266、KM3MV抑制CFU-F形成(P<0.01、P<0.05、P<0.05),K562MV無(wú)抑制作用(P>0.05);8226、U266、KM3MV顯著抑制CFU-OB形成(P<0.01),8226MV作用強(qiáng)于U266MV(P<0.05);而K562MV無(wú)作用。④誘導(dǎo)d3,d6MV下調(diào)osteocalcin mRNA表達(dá)(P<0.01);誘導(dǎo)d6,MM-MV下調(diào)RUNX2mRNA表達(dá),K562MV無(wú)作用;U266

6、、KM3MV抑制ALP mRNA表達(dá);U266MV抑制CollagenⅠmRNA表達(dá)。⑤誘導(dǎo)d6,U266MV抑制骨鈣蛋白分泌(P<0.05);d9,d12骨鈣蛋白分泌顯著受抑(P<0.01)。⑥誘導(dǎo)d6,8226、KM3MV抑制ALP活性(P<0.01、P<0.05);誘導(dǎo)d12,MV組ALP活性均減低,以8226MV作用最為顯著(P<0.01)。
　　結(jié)論:MM-MV抑制MSCs成骨分化
　　第三部分:MM-MV抑制MS

7、Cs成骨分化機(jī)制研究
　　目的:MM-MV抑制MSCs成骨分化機(jī)制研究
　　方法:Western blot法檢測(cè)MM細(xì)胞、MM-MV內(nèi)DKK-1、sFRP2、IL-7的表達(dá)。ALP染色法觀察IL-7中和抗體對(duì)U266、KM3MV成骨抑制的阻斷效應(yīng)。Western blot法檢測(cè)RUNX2蛋白、β-catenin、磷酸化及去磷酸化水平。ELISA法檢測(cè)RUNX2活性。結(jié)果:①M(fèi)M-MV選擇性包裝成骨抑制因子sFRP2、IL-7

8、。8226、KM3細(xì)胞表達(dá)DKK1而其MV不表達(dá);8226、U266、KM3細(xì)胞不表達(dá)sFRP2,而8226MV、KM3MV表達(dá);8226、U266、KM3細(xì)胞均表達(dá)IL-7,表達(dá)強(qiáng)弱順序依次為KM3、8226、U266,而MV內(nèi)IL-7表達(dá)卻相反,U266MV濃縮表達(dá)IL-7,高于其母體細(xì)胞,而8226MV內(nèi)IL-7表達(dá)低于細(xì)胞,KM3MV表達(dá)量極低。②IL-7中和抗體阻斷U266MV成骨抑制效應(yīng)(P<0.05),對(duì)KM3MV無(wú)阻斷作

9、用(P>0.05)。③8226、U266MV抑制RUNX2蛋白表達(dá)及活性。④MM-MV作用一周后,MSCs胞漿內(nèi)磷酸化β-catenin蛋白水平明顯升高;8226、KM3MV導(dǎo)致胞漿β-catenin磷酸化強(qiáng)于 U266MV,與MV內(nèi)sFRP2表達(dá)水平基本一致。
　　結(jié)論:MV成骨抑制作用取決于其包裝的分子內(nèi)容物。8226MV表達(dá)IL-7、sFRP2,通過(guò)Wnt/β-catenin及RUNX2雙通路作用MSCs,成骨抑制最強(qiáng);U2