長鏈非編碼RNa-PCA3在前列腺癌中的功能及分子機制的初步研究.pdf

1、第一部分、pGLV3/H1-shRNA干擾穩(wěn)轉株及pCDH-GFP-PCA3過表達穩(wěn)轉株的篩選與驗證
　　目的:PCA3基因在前列腺癌中高度特異性的表達，預示著PCA3對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。目前，PCA3在前列腺癌中的功能及機制尚不清楚。為了探究其功能，我們通過構建PCA3的干擾及過表達載體，并篩選出相應的穩(wěn)轉株，為后續(xù)的體外功能研究提供依據。
　　方法:從Genbank中查找PCA3基因的序列號及其對應序列，使

2、用Premier5.0軟件設計針對PCA3分子的shRNA，分別構建4對pGLV3/H1-sh2456，pGLV3/H1-sh2618，pGLV3/H1-sh2702及pGLV3/H1-sh2913干擾載體及pGLV3/H1-control對照，以下調其在LNCaP細胞中的表達。將構建好的干擾載體包裝成病毒后感染LNCaP細胞，經realtime PCR驗證后篩選出干擾效率較高的細胞株;從PCA3高表達的前列腺癌細胞系LNCaP中提取總

3、RNA，然后反轉錄成cDNA。設計三對引物，以cDNA為模板擴增3個分片段，通過重疊延伸后連接成全長構成PCA3。將PCA3與pCDH-GFP質粒分別進行雙酶切后進行連接，轉化感受態(tài)細胞DH5α，挑選克隆后并經PCR、酶切進行驗證，送測序。將構建好的pCDH-GFP-PCA3表達質粒包裝成病毒后感染前列腺癌細胞株DU145及PC3，流式分選并經real time PCR驗證后獲得分別過表達PCA3及含空載的穩(wěn)定細胞株。
　　結果:

4、測序結果表明成功構建了干擾載體，而且real time PCR結果同時證實并建立了穩(wěn)定低表達PCA3的前列腺癌細胞株及穩(wěn)定高表達PCA3的前列腺癌細胞株。
　　結論:PCA3干擾及過表達載體的成功構建，為深入研究PCA3基因在前列腺細胞中的作用奠定了基礎，進而為探索前列腺癌治療的新途徑提供了可能。
　　第二部分、研究PCA3干擾和過表達后對前列腺癌細胞功能的影響及機制的初步研究
　　目的:研究PCA3干擾和過表達后在體

5、外對前列腺癌細胞的增殖、周期、遷移及侵襲的影響。
　　方法:將第一部分篩選出的穩(wěn)轉細胞株，通過CCK-8法(PCA3過表達實驗)和EdU法（PCA3干擾實驗）及細胞克隆形成實驗測定細胞增殖能力，通過流式細胞儀測定細胞周期，transwell小室檢測細胞的遷移及侵襲能力。并將存在功能差異的干擾細胞進行轉錄組測序，探求兩組細胞在轉錄水平分子的表達差異。
　　結果:下調PCA3的表達后，LNCaP細胞株實驗組較對照組的增殖能力下降

6、(P＜0.05)，且遷移（P=0.0001）與侵襲（P＜0.0001）能力也顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義。而在DU145及PC3細胞中過表達PCA3后，細胞在增殖、遷移及侵襲的生物學功能方面與對照組相比無明顯差異。轉錄組測序結果發(fā)現(xiàn)，下調PCA3分子后，實驗組中與細胞粘附信號通路的基因表達有明顯的下降，而參與TGF-beta信號通路的基因表達明顯上升。
　　結論:PCA3可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，下調PCA3后能顯著抑制