頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表皮生長因子受體的表達(dá)、單核苷酸多態(tài)性及基因表達(dá)調(diào)控的初步研究.pdf

1、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN）指發(fā)生于口腔、咽、喉、鼻腔、鼻竇、唾液腺、頸段氣管及食管的鱗狀細(xì)胞癌，其組織來源于上呼吸消化道的粘膜上皮細(xì)胞。2003年統(tǒng)計(jì)SCCHN每年在世界范圍內(nèi)大約有540，000例新發(fā)病例，其中可造成271，000例死亡病例，死亡率超過50％。由于SCCHN具有局部浸潤生長、易原位復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，目前其治療仍然是一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的臨床課題，其發(fā)病率及死亡率較高。雖然外科手術(shù)、放射治療及輔助化療等治療方法的綜合應(yīng)

2、用在一定程度上提高SCCHN患者生存率，但大部分研究表明其晚期患者5年生存率仍僅在30％和40％之間。因此研究SCCHN發(fā)生過程中的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)于SCCHN的早期診斷以及為SCCHN的治療提供新靶點(diǎn)具有重要意義。表皮生長因子受體（EGFR）是一種分子量為170 kDa的糖蛋白，其編碼基因位于染色體7p12，包含28個(gè)外顯子，屬于ErbB受體家族。EGFR的活化可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管形成。其異常活化可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖及

3、其他促進(jìn)腫瘤增長的反應(yīng)，并可增加腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移的潛能。研究表明在多種上皮源性腫瘤包括SCCHN中均存在EGFR的表達(dá)異常，其中大部分表現(xiàn)為EGFR的過表達(dá)，其表達(dá)可能與SCCHN的預(yù)后密切相關(guān)，因此EGFR基因被視為可能的SCCHN治療的新靶點(diǎn)。因此，研究SCCHN中EGFR基因表達(dá)、關(guān)鍵外顯子的突變或單核苷酸多態(tài)性與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，并進(jìn)一步分析其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有助于深入理解SCCHN發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)于SCCHN的分子靶向

4、治療有指導(dǎo)意義。本研①利用PCR技術(shù)檢測了中國SCCHN患者新鮮組織標(biāo)本中EGFR的表達(dá)改變，分析了EGFR表達(dá)與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系；②通過PCR及直接測序的方法證實(shí)在中國SCCHN患者中存在EGFR外顯子的單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象，并分析了其與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系；③克隆了人EGFR基因上游2875 bp的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)片段，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、報(bào)道基因分析、缺失突變分析、RT-PCR、Western blot等方法研究了該區(qū)域的啟動(dòng)子活性，

5、并對(duì)該區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行了初步分析。 1.[研究目的]研究頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中EGFR表達(dá)改變及其與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。 [研究方法] ①收集96例原發(fā)SCCHN腫瘤組織，并收集距腫瘤切緣1 cm以上部位的形態(tài)學(xué)正常的粘膜組織作為對(duì)照。 ②TRIzol法分別提取腫瘤組織和正常粘膜組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)EGFR基因組序列合成EGFR特異性引物，以5S RNA為內(nèi)參照，通

6、過PCR檢測腫瘤組織和正常粘膜組織中EGFR表達(dá)水平的差異。 ③應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？ǚ浇y(tǒng)計(jì)分析EGFR表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，非參數(shù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用于不適用卡方統(tǒng)計(jì)者；Kaplan-Meier生存率分析及Cox回歸模型繪制生存率曲線并分析預(yù)后，無病生存期的計(jì)算采取自診斷之日起至明確證明發(fā)生局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。所有的統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，取P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] ①在

7、96例SCCHN臨床標(biāo)本中，74例（77.1％）腫瘤組織對(duì)比其臨近的形態(tài)學(xué)正常的組織出現(xiàn)EGFR表達(dá)異常；其中47例（49.0％）過表達(dá)，27例（28.1％）低表達(dá)。 ②EGFR表達(dá)與性別、腫瘤大?。═分期）、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）及飲酒無關(guān)；與年齡、腫瘤的原發(fā)部位、組織分化程度、臨床分期及吸煙有關(guān)。 ③EGFR的過表達(dá)主要發(fā)生于年齡小于60歲的吸煙者、原發(fā)于口咽或喉咽部的腫瘤、中低分化的腫瘤及臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的SCC

8、HN患者。 ④生存率分析表明EGFR表達(dá)與SCCHN的預(yù)后無關(guān)，目前數(shù)據(jù)并不支持其作為SCCHN患者獨(dú)立的預(yù)后因素。 [結(jié)論] ①在SCCHN患者腫瘤組織中存在EGFR的表達(dá)異常。 ②過表達(dá)EGFR的SCCHN多原發(fā)于喉咽及口咽部。 ③吸煙可能引起EGFR的表達(dá)增加。 ④EGFR是SCCHN發(fā)生及發(fā)展過程中的重要影響因子，起到了癌蛋白的作用； 2.[研究目的]研究中國頭頸部鱗狀細(xì)胞

9、癌患者EGFR基因第18～21號(hào)外顯子中是否存在突變或單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象，并進(jìn)一步研究及其與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。 [研究方法] ①收集96例原發(fā)SCCHN腫瘤組織，并收集距腫瘤切緣1cm以上部位的形態(tài)學(xué)正常的粘膜組織作為對(duì)照。 ②提取腫瘤組織及正常粘膜組織中的基因組DNA。根據(jù)EGFR基因第18、19、20、21號(hào)外顯子序列分別設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳回收上述四條外顯子目的帶，雙向測序，檢測其是否存

10、在基因突變或單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象。 ③應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本率的比較采用u檢驗(yàn)；卡方統(tǒng)計(jì)分析測序結(jié)果臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，非參數(shù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用于不適用卡方統(tǒng)計(jì)者；Kaplan-Meier生存率分析及Cox回歸模型繪制生存率曲線并分析預(yù)后，無病生存期的計(jì)算采取自診斷之日起至明確證明發(fā)生局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。 [結(jié)果] ①對(duì)EGFR基因18～21號(hào)外顯子的DNA測序表明，在中國SCCHN

11、患者中EGFR基因18～21號(hào)外顯子未發(fā)現(xiàn)明顯突變；22例（22.9％）患者的20號(hào)外顯子存在單核苷酸多態(tài)性（SNP），其第78號(hào)位點(diǎn)的鳥嘌呤（G）被腺嘌呤（A）取代。密碼由CAG變?yōu)镃AA，相應(yīng)的氨基酸（谷氨酰胺）并沒有改變。這表明這是一個(gè)同義的單核甘酸多態(tài)（sSNP）。 ②上述22例患者EGFR基因20號(hào)外顯子單核苷酸多態(tài)均為G/A雜合。 ③中國SCCHN患者中EGFR基因20號(hào)外顯子G/A雜合sSNP出現(xiàn)率與Gen

12、eBank正常亞洲人的數(shù)據(jù)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ④G/A雜合sSNP與組織分化程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與原發(fā)部位、T分期及臨床分期有關(guān)。 ⑤G/A雜合sSNP主要存在于T1～2、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期及原發(fā)于喉咽的SCCHN中。 ⑥該sSNP與EGFR的表達(dá)無明顯相關(guān)性。 ⑦生存率分析表明G/A雜合患者與G/G純合患者的生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，目前的數(shù)據(jù)不能支持該sSNP為SCCNH獨(dú)立的預(yù)后因素。

13、[結(jié)論] ①中國SCCHN患者中EGFR基因18～21號(hào)外顯子發(fā)生突變的概率較低。 ②中國SCCHN患者中EGFR基因20號(hào)外顯子第78號(hào)位點(diǎn)G/A雜合sSNP的發(fā)生率高于健康人群。 ③EGFR基因20號(hào)外顯子第78位的sSNP可能成為一個(gè)有效的預(yù)測SCCHN，尤其是喉咽部鱗狀細(xì)胞癌臨床過程的指標(biāo)。 ④EGFR基因20號(hào)外顯子第78位的sSNP與EGFR的表達(dá)無關(guān)。 ⑤目前的數(shù)據(jù)并不支持且EGFR

14、基因20號(hào)外顯子sSNP是中國SCCHN患者無病生存率的獨(dú)立的預(yù)后因素。 3.[研究目的]克隆人EGFR基因5’上游2875 bp的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)片段，對(duì)該區(qū)域可能存在的功能性順式作用元件進(jìn)行初步分析。 [研究方法] ①提取人基因組DNA，PCR擴(kuò)增EGFR基因5’上游2875 bp（-2644～+231bp）啟動(dòng)調(diào)控區(qū)序列，插入pGL3-Basic，構(gòu)建EGFR基因啟動(dòng)調(diào)控區(qū).熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)載體pGL3-EG

15、FR-2875，酶切鑒定和測序分析證實(shí)插入片段是否正確。 ②pGL3-EGFR-2875瞬時(shí)轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞株Hep-2，熒光素酶報(bào)道基因分析檢測啟動(dòng)子活性。 ③將C/EBPα等蛋白因子表達(dá)載體與pGL3-EGFR-2875共轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，報(bào)道基因分析觀察C/EBPα等蛋白因子對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。 ④應(yīng)用RT-PCR和Western blot技術(shù)驗(yàn)證C/EBPα等蛋白因子的作用。 ⑤在pGL3-EGFR

16、-2875基礎(chǔ)上構(gòu)建了3個(gè)較大范圍的5’缺失突變體，與C/EBPα表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，報(bào)道基因分析觀察缺失突變對(duì)啟動(dòng)子活性的影響，并分析C/EBPα表達(dá)載體可能的作用區(qū)域。 [結(jié)果] ①構(gòu)建了較大范圍的EGFR基因5’上游啟動(dòng)調(diào)控區(qū)重組質(zhì)粒pGL3-EGFR-2875，酶切鑒定及DNA測序結(jié)果正確。 ②pGL3-EGFR-2875在Hep-2細(xì)胞呈現(xiàn)很強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。 ③共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C/E

17、BPα的表達(dá)載體明顯抑制EGFR啟動(dòng)子活性，RT-PCR和Western blot進(jìn)一步證實(shí)C/EBPα對(duì)EGFR表達(dá)的抑制作用。 ④pGL3-EGFR-2875的缺失突變分析顯示，C/EBPα表達(dá)載體的作用區(qū)域可能位于-618～+231 bp內(nèi)。 ⑤-1619～-871 bp區(qū)域的缺失可導(dǎo)致啟動(dòng)子活性下降72％，說明該區(qū)域可能存在功能性正調(diào)控元件。 [結(jié)論] ①正確克隆了人EGFR基因上游2875 bp