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1、第一部分 遺傳性高鈣尿大鼠維生素D受體基因SNP與特發(fā)性高鈣尿癥的相關(guān)性研究 目的:建立具有人類特發(fā)性高鈣尿相似特點(diǎn)并且能夠穩(wěn)定遺傳的高鈣尿大鼠模型,探討GHS大鼠維生素D受體基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與特發(fā)性高鈣尿癥之間有無(wú)相關(guān)性。 方法:將80只SD大鼠分別單獨(dú)置于鼠代謝籠,收集連續(xù)兩次24小時(shí)尿并測(cè)定尿鈣,有最大尿鈣值的3只雄鼠和雌鼠被選擇繁殖后代,以后同此法選擇3~4只雄鼠和4~6只雌鼠繼續(xù)繁殖。然后提
2、取42例GHS大鼠及24例正常對(duì)照大鼠全血標(biāo)本中基因組DNA,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合DNA測(cè)序方法檢測(cè)并分析了VDR基因5’-調(diào)控區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分布。 結(jié)果:在實(shí)驗(yàn)組中,80%(12/15)的雄鼠和56%(9/16)的雌鼠24h尿鈣排泄明顯高于對(duì)照組(2.98+1.16)和(2.54+1.04)mg/d,無(wú)論性別實(shí)驗(yàn)組大鼠的尿鈣排泄明顯高于對(duì)照組(P<0.05),檢測(cè)血中鈣,磷兩組均無(wú)明顯區(qū)別,1,25(OH)2D3
3、水平不高(P>0.05)。GHS大鼠VDR基因5’-調(diào)控區(qū)共發(fā)現(xiàn)6個(gè)多態(tài)位點(diǎn),將這些多態(tài)位點(diǎn)基因型變化與正常組比較,其中兩個(gè)位點(diǎn)存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論:本研究成功地建立的大鼠實(shí)驗(yàn)性遺傳性高鈣尿癥模型。遺傳高鈣尿鼠模型具有和人類該疾病相似的遺傳背景,是研究IH在尿結(jié)石形成中的作用機(jī)制的一種很好的模型。研究還提示GHS大鼠VDR基因5’-調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性在GHS大鼠特發(fā)性高鈣尿的發(fā)生中可能起到重要作用。 第二部分
4、 論文一 大鼠VDR組織特異性啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建 目的:為進(jìn)行VDR基因啟動(dòng)子的活性分析,構(gòu)建含大鼠VDR基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因重組表達(dá)質(zhì)粒。 方法:以大鼠VDR基因組DNA為模板,通過PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游DNA序列。PCR產(chǎn)物定向克隆到含熒光素酶報(bào)告基因的載體pGL3-Basic中,并經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化鑒定。 結(jié)果:通過酶切鑒定和基因測(cè)序,證明成功地構(gòu)建了含大鼠VDR
5、基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因的載體pGL3-GHS-Luc和pGL3-N-Luc。兩種質(zhì)粒僅僅存在兩處單核苷酸的差異。 結(jié)論:成功構(gòu)建了含大鼠VDR啟動(dòng)子片段的報(bào)告基因載體,為分析VDR基因啟動(dòng)子的活性以及VDR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 論文二 大鼠VDR基因多態(tài)性對(duì)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平的影響 目的:研究VDR基因5’端啟動(dòng)子序列對(duì)熒光素酶在Hela細(xì)胞中表達(dá)的影響,評(píng)價(jià)VDR基因啟動(dòng)子對(duì)下游基
6、因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 方法:將構(gòu)建的不同大鼠VDR啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體pGL3-GHS-luc、pGL3-N-luc及空載pGL3-Basic經(jīng)lipofectin轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,G418抗性篩選得到含各不同質(zhì)粒的穩(wěn)定陽(yáng)性細(xì)胞克隆,檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶表達(dá)。 結(jié)果:所構(gòu)建的報(bào)告基因均能在Hela細(xì)胞中表達(dá),pGL3-GHS載體轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞熒光素酶表達(dá)水平高于pGL3-N載體。 結(jié)論:VDR基因5’-調(diào)控區(qū)SN
7、P在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平存在差異,這些差異可能對(duì)特發(fā)性高鈣尿癥的發(fā)生機(jī)制存在一定的影響。 第三部分 大鼠VDR基因5’端非編碼區(qū)啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建和分析 目的:克隆大鼠VDR基因基因啟動(dòng)子,構(gòu)建含VDR基因啟動(dòng)子不同片段的報(bào)告基因載體,在Hela細(xì)胞中分析各種載體中VDR啟動(dòng)子活性。 方法:PCR、報(bào)告基因載體構(gòu)建、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因檢測(cè)。 結(jié)果:通過PCR方法獲得VDR啟動(dòng)子的3個(gè)不同片段,將它們
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