結直腸癌Duffy抗原趨化因子受體的表達及單核苷酸多態(tài)性的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　結直腸癌是全球范圍內(nèi)在女性中排在第二位，而在男性中排在第三位的惡性腫瘤。趨化因子及其受體在調(diào)節(jié)結直腸癌的生長、血管生成以及轉移中發(fā)揮重大作用。Duffy抗原趨化因子受體(Duffyantigenreceptorforchemokines，DARC)屬于“沉默”趨化因子家族中的一員，它是位于紅細胞以及內(nèi)皮細胞等表面的一種糖蛋白，也是紅細胞上的一種血型抗原，又稱Duffy抗原。DARC基因序列的單核苷酸多態(tài)性(s

2、inglenucleotidepolymorphism，SNP)rs12075位點形成了2個等位基因，分別為FY*A和FY*B，分別編碼Duffy血型系統(tǒng)的Fya和Fyb抗原。DARC能特異性的結合一些促血管生成的趨化因子而不能啟動趨化因子胞內(nèi)信號傳導通路，僅僅發(fā)揮清除趨化因子的作用。促進血管生成的趨化因子在結直腸癌的生長、血管生成、轉移以及預后中發(fā)揮重要的作用。這提示DARC的表達或許和結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。
　　結直腸癌遺

3、傳易感性因素包括染色體和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及一些原癌基因和抑癌基因的分子突變以及SNP等。目前，許多研究已證實多種基因的SNP和結直腸癌易感性有關。有研究發(fā)現(xiàn)DARC的SNP位點rs12075與乳腺癌轉移有關。這也提示DARCrs12075位點的基因多態(tài)性可能也與結直腸癌有關。
　　隨著DARC基因序列的闡明，很多基因分型方法，如聚合酶鏈反應-等位基因特異性引物(polymerasechainreactionwithallele-s

4、pecificprimers，PCR-ASP)和聚合酶鏈反應-限制性片段多態(tài)性(polymerasechainreactionwithrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)等方法被用于DARC基因分型。然而這些方法均存在著需要電泳操作等缺點。因此開發(fā)一種新的簡單、快速、高通量的DARC基因分型方法，將為研究DARC基因多態(tài)性和疾病的相關性以及在輸血醫(yī)學中鑒定Duffy血型的基因型提

5、供一個有效的工具。
　　本研究的目的是通過檢測結直腸癌DARC、CD34以及金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的表達，探討結直腸癌DARC表達在結直腸癌中的作用。此外，建立一個用于DARC的SNP位點rs12075的基因分型的TaqMan-MGB探針實時PCR方法，對這個方法進行評價。并用該方法對結直腸癌和對照人群的DARC的rs12075位點進行基因分型，探討DARC的rs12075位點基因多態(tài)性和結直腸癌的相關性。同時也分析DA

6、RC基因型和紅細胞趨化因子清除功能以及表達的關系，從紅細胞DARC表達和功能的角度，闡明DARC基因多態(tài)性影響結直腸癌的機制。
　　方法:
　　1.收集結直腸癌組織以及對照組織標本，應用實時PCR技術定量檢測DARC的mRNA表達水平。應用免疫組織化學染色技術檢測DARC、CD34以及MMP-9的蛋白表達。通過CD34的表達情況計數(shù)微血管密度(microvesseldensity,MVD)。
　　2.設計針對DARC的

7、SNP位點rs12075的TaqMan-MGB探針和引物，建立一個用于DARC基因分型的TaqMan-MGB探針實時PCR方法。用建立的方法對120個樣本進行基因分型。并將該基因分型方法和PCR-ASP方法進行比較。此外，確定該方法的最低檢出限和重復性。
　　3.收集結直腸癌和對照人群血樣，應用建立的DARC基因分型方法對血樣進行基因分型。應用流式細胞術檢測不同DARC基因型的紅細胞表面DARC的表達。應用ELISA技術檢測不同D

8、ARC基因型的紅細胞趨化因子清除能力。
　　結果:
　　1.結直腸癌組織和正常結直腸組織中DARC蛋白和mRNA的表達
　　在90例結直腸癌組織中，DARC蛋白表達陽性66例(73.3％)，64例正常結直腸組織DARC的蛋白表達均為陽性(100％)。結直腸癌組織DARC表達陽性率要顯著低于正常結直腸組織(P＜0.001)。結直腸癌組織DARC的mRNA表達水平要顯著低于正常結直腸組織(P=0.012)，平均降低4倍。無

9、論在結直腸癌組織還是在正常結直腸組織，DARC蛋白表達水平和mRNA表達水平呈正相關(P＜0.001)。
　　2.結直腸癌組織DARC蛋白表達和病理特征的相關性
　　DARC蛋白表達與淋巴結轉移狀態(tài)以及TNM分期呈負相關（P＜0.05），而與腫瘤分化程度呈正相關(P＜0.001)。未發(fā)現(xiàn)DARC蛋白表達與其它特征如年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度腫瘤部位以及遠處轉移等有關。
　　3.結直腸癌組織和正常結直腸組織中MMP-

10、9的表達
　　在90例結直腸癌組織中，MMP-9蛋白表達陽性72例(80.0％)，在64例正常結直腸組織中，DARC的蛋白表達陽性33例(51.6％)。結直腸癌組織MMP-9表達陽性率要顯著高于正常結直腸組織(P＜0.001)。
　　4.結直腸癌組織MMP-9表達和病理特征的相關性
　　MMP-9表達與淋巴結轉移狀態(tài)以及TNM分期呈正相關（P＜0.05），而與腫瘤分化程度呈負相關(P=0.037)。未發(fā)現(xiàn)MMP-9表達

11、和其它特征如年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度腫瘤部位以及遠處轉移等有關。
　　5.結直腸癌組織MVD和病理特征的相關性
　　MVD與淋巴結轉移狀態(tài)以及TNM分期呈正相關(P＜0.01)，而與腫瘤分化程度呈負相關(P=0.009)。未發(fā)現(xiàn)MVD和其它特征如年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度腫瘤部位以及遠處轉移等有關。
　　6.結直腸癌組織DARC蛋白表達與MVD以及MMP-9表達的相關性
　　結直腸癌組織DARC蛋白表達

12、和MVD呈負相關(P＜0.001)，和MMP-9表達也呈負相關(P＜0.001)。MMP-9表達和MVD呈正相關(P＜0.001)。
　　7.TaqMan-MGB探針實時PCR與PCR-ASP的比較
　　TaqMan-MGB探針實時PCR與PCR-ASP方法的基因分型結果是完全一致的。
　　8.TaqMan-MGB探針實時PCR的重復性及最低檢出限
　　選取5個基因型為FY*A/FY*A，5個基因型為FY*A/F

13、Y*B和1個基因型為FY*B/FY*B的樣本進行TaqMan-MGB探針實時PCR的重復檢測，結果和初次檢測結果完全一致。對于純合子FY*A/FY*A和FY*B/FY*B樣本，TaqMan-MGB探針實時PCR的最低檢測限是50pg，而對于雜合子FY*A/FY*B的最低檢測限是100pg。
　　9.大連漢族獻血人群FY*A、FY*B的基因頻率分布特點、Duffy抗原不配合機率及其與其它地區(qū)人群基因頻率的比較
　　在隨機輸血情

14、況下，F(xiàn)ya抗原不配合的幾率為0.1123，F(xiàn)yb抗原不配合的幾率為0.0044。二者合計不配合幾率為0.1167。在大連漢族人群，F(xiàn)Y*A基因頻率高達93.3％，遠高于FY*B的基因頻率(6.7％)。大連漢族人群FY*A、FY*B的基因頻率分布與國內(nèi)其他地區(qū)漢族人群相比，無顯著性差異，但與浙江畬族相比，有顯著性差異(P=0.015)。
　　10.結直腸癌病例組和對照組DARC基因型分布的比較
　　在306例對照組人群中，基

15、因型FY*A/FY*A為266例，F(xiàn)Y*A/FY*B為39例。FY*B/FY*B為1例。在325例結直腸癌患者中，基因型FY*A/FY*A為286例，F(xiàn)Y*A/FY*B為38例。FY*B/FY*B為1例。尚未發(fā)現(xiàn)DARC基因型和結直腸癌的發(fā)生有關。
　　11.DARC基因型和結直腸癌患者的病理特征的關系
　　在淋巴結轉移陰性組DARC的基因型FY*A/FY*B和FY*B/FY*B組合的基因型頻率(16.7％)高于淋巴結轉移陽

16、性組FY*A/FY*B和FY*B/FY*B組合的基因型頻率(8.6％)，而FY*A/FY*A的基因型頻率(83.3％)要低于淋巴結轉移陽性組的基因型頻率(91.4％)(P=0.026)?；蛐虵Y*A/FY*A的結直腸癌患者要比非FY*A/FY*A基因型的患者發(fā)生淋巴結轉移的風險高2.137倍。
　　12.DARC基因型和紅細胞趨化因子清除功能的關系
　　DARC基因型FY*A/FY*A的紅細胞的CXCL8的清除能力要顯著低

17、于基因型FY*A/FY*B的紅細胞（P=0.016）。DARC基因型FY*A/FY*A的紅細胞的CCL2的清除能力要顯著低于基因型FY*A/FY*B的紅細胞(P=0.038)。
　　13.DARC基因型和紅細胞膜表面DARC表達的關系
　　基因型FY*A/FY*A的紅細胞表面DARC的表達水平明顯高于基因型FY*A/FY*B的紅細胞(P=0.021)。
　　結論:
　　1.DARC的表達在結直腸癌中是下調(diào)的，而這

18、個下調(diào)可能參與了結直腸癌的發(fā)生進程。
　　2.DARC的表達是與結直腸癌淋巴結轉移、TNM分期、MVD以及MMP-9呈負相關，而與腫瘤分化呈正相關。
　　3.DARC可能是通過降低微環(huán)境中促血管生成性趨化因子和MMP-9含量，抑制結直腸癌組織血管生成，進而抑制結直腸癌的進展和轉移。
　　4.DARC或許是結直腸癌生成、進展、血管生成以及轉移的負性調(diào)節(jié)因子以及潛在的預后指標和分子治療靶點。
　　5.DARC的Taq

19、Man-MGB探針實時PCR基因分型方法具有快速、簡單、靈敏、重復性好、通量高、交叉污染風險小等特點，而且實現(xiàn)了結果自動判讀，要優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR-ASP方法。
　　6.在大連漢族人群中，等位基因FY*A的基因頻率占優(yōu)勢，要遠遠高于FY*B。大連漢族人群DARC基因頻率分布特點和國內(nèi)其他地區(qū)漢族人群相似，但和畬族DARC基因頻率相比有顯著性差異，提示DARC等位基因分布具有民族差異。
　　7.在隨機輸血情況下，F(xiàn)ya和Fyb抗

20、原不配合的機率為0.1167。這提示在臨床輸血時，因Duffy血型不合引起的免疫反應的風險不容忽視。
　　8.DARC的rs12075位點基因多態(tài)性和結直腸癌的發(fā)生無關。
　　9.DARC的rs12075位點基因多態(tài)性和結直腸癌的淋巴結轉移以及TNM分期有關?；蛐虵Y*A/FY*A結直腸癌患者相對于非FY*A/FY*A患者更易發(fā)生淋巴結轉移。
　　10.DARC的rs12075位點基因多態(tài)性影響紅細胞DARC的蛋白表