結(jié)直腸癌Duffy抗原趨化因子受體的表達及單核苷酸多態(tài)性的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)在女性中排在第二位，而在男性中排在第三位的惡性腫瘤。趨化因子及其受體在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的生長、血管生成以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重大作用。Duffy抗原趨化因子受體(Duffyantigenreceptorforchemokines，DARC)屬于“沉默”趨化因子家族中的一員，它是位于紅細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等表面的一種糖蛋白，也是紅細(xì)胞上的一種血型抗原，又稱Duffy抗原。DARC基因序列的單核苷酸多態(tài)性(s

2、inglenucleotidepolymorphism，SNP)rs12075位點形成了2個等位基因，分別為FY*A和FY*B，分別編碼Duffy血型系統(tǒng)的Fya和Fyb抗原。DARC能特異性的結(jié)合一些促血管生成的趨化因子而不能啟動趨化因子胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，僅僅發(fā)揮清除趨化因子的作用。促進血管生成的趨化因子在結(jié)直腸癌的生長、血管生成、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。這提示DARC的表達或許和結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
　　結(jié)直腸癌遺

3、傳易感性因素包括染色體和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及一些原癌基因和抑癌基因的分子突變以及SNP等。目前，許多研究已證實多種基因的SNP和結(jié)直腸癌易感性有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)DARC的SNP位點rs12075與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。這也提示DARCrs12075位點的基因多態(tài)性可能也與結(jié)直腸癌有關(guān)。
　　隨著DARC基因序列的闡明，很多基因分型方法，如聚合酶鏈反應(yīng)-等位基因特異性引物(polymerasechainreactionwithallele-s

4、pecificprimers，PCR-ASP)和聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段多態(tài)性(polymerasechainreactionwithrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)等方法被用于DARC基因分型。然而這些方法均存在著需要電泳操作等缺點。因此開發(fā)一種新的簡單、快速、高通量的DARC基因分型方法，將為研究DARC基因多態(tài)性和疾病的相關(guān)性以及在輸血醫(yī)學(xué)中鑒定Duffy血型的基因型提

5、供一個有效的工具。
　　本研究的目的是通過檢測結(jié)直腸癌DARC、CD34以及金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的表達，探討結(jié)直腸癌DARC表達在結(jié)直腸癌中的作用。此外，建立一個用于DARC的SNP位點rs12075的基因分型的TaqMan-MGB探針實時PCR方法，對這個方法進行評價。并用該方法對結(jié)直腸癌和對照人群的DARC的rs12075位點進行基因分型，探討DARC的rs12075位點基因多態(tài)性和結(jié)直腸癌的相關(guān)性。同時也分析DA

6、RC基因型和紅細(xì)胞趨化因子清除功能以及表達的關(guān)系，從紅細(xì)胞DARC表達和功能的角度，闡明DARC基因多態(tài)性影響結(jié)直腸癌的機制。
　　方法:
　　1.收集結(jié)直腸癌組織以及對照組織標(biāo)本，應(yīng)用實時PCR技術(shù)定量檢測DARC的mRNA表達水平。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測DARC、CD34以及MMP-9的蛋白表達。通過CD34的表達情況計數(shù)微血管密度(microvesseldensity,MVD)。
　　2.設(shè)計針對DARC的

7、SNP位點rs12075的TaqMan-MGB探針和引物，建立一個用于DARC基因分型的TaqMan-MGB探針實時PCR方法。用建立的方法對120個樣本進行基因分型。并將該基因分型方法和PCR-ASP方法進行比較。此外，確定該方法的最低檢出限和重復(fù)性。
　　3.收集結(jié)直腸癌和對照人群血樣，應(yīng)用建立的DARC基因分型方法對血樣進行基因分型。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同DARC基因型的紅細(xì)胞表面DARC的表達。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測不同D

8、ARC基因型的紅細(xì)胞趨化因子清除能力。
　　結(jié)果:
　　1.結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中DARC蛋白和mRNA的表達
　　在90例結(jié)直腸癌組織中，DARC蛋白表達陽性66例(73.3％)，64例正常結(jié)直腸組織DARC的蛋白表達均為陽性(100％)。結(jié)直腸癌組織DARC表達陽性率要顯著低于正常結(jié)直腸組織(P＜0.001)。結(jié)直腸癌組織DARC的mRNA表達水平要顯著低于正常結(jié)直腸組織(P=0.012)，平均降低4倍。無

9、論在結(jié)直腸癌組織還是在正常結(jié)直腸組織，DARC蛋白表達水平和mRNA表達水平呈正相關(guān)(P＜0.001)。
　　2.結(jié)直腸癌組織DARC蛋白表達和病理特征的相關(guān)性
　　DARC蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)以及TNM分期呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與腫瘤分化程度呈正相關(guān)(P＜0.001)。未發(fā)現(xiàn)DARC蛋白表達與其它特征如年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度腫瘤部位以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)。
　　3.結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中MMP-

10、9的表達
　　在90例結(jié)直腸癌組織中，MMP-9蛋白表達陽性72例(80.0％)，在64例正常結(jié)直腸組織中，DARC的蛋白表達陽性33例(51.6％)。結(jié)直腸癌組織MMP-9表達陽性率要顯著高于正常結(jié)直腸組織(P＜0.001)。
　　4.結(jié)直腸癌組織MMP-9表達和病理特征的相關(guān)性
　　MMP-9表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)以及TNM分期呈正相關(guān)（P＜0.05），而與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)(P=0.037)。未發(fā)現(xiàn)MMP-9表達

11、和其它特征如年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度腫瘤部位以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)。
　　5.結(jié)直腸癌組織MVD和病理特征的相關(guān)性
　　MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)以及TNM分期呈正相關(guān)(P＜0.01)，而與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)(P=0.009)。未發(fā)現(xiàn)MVD和其它特征如年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度腫瘤部位以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)。
　　6.結(jié)直腸癌組織DARC蛋白表達與MVD以及MMP-9表達的相關(guān)性
　　結(jié)直腸癌組織DARC蛋白表達

12、和MVD呈負(fù)相關(guān)(P＜0.001)，和MMP-9表達也呈負(fù)相關(guān)(P＜0.001)。MMP-9表達和MVD呈正相關(guān)(P＜0.001)。
　　7.TaqMan-MGB探針實時PCR與PCR-ASP的比較
　　TaqMan-MGB探針實時PCR與PCR-ASP方法的基因分型結(jié)果是完全一致的。
　　8.TaqMan-MGB探針實時PCR的重復(fù)性及最低檢出限
　　選取5個基因型為FY*A/FY*A，5個基因型為FY*A/F

13、Y*B和1個基因型為FY*B/FY*B的樣本進行TaqMan-MGB探針實時PCR的重復(fù)檢測，結(jié)果和初次檢測結(jié)果完全一致。對于純合子FY*A/FY*A和FY*B/FY*B樣本，TaqMan-MGB探針實時PCR的最低檢測限是50pg，而對于雜合子FY*A/FY*B的最低檢測限是100pg。
　　9.大連漢族獻血人群FY*A、FY*B的基因頻率分布特點、Duffy抗原不配合機率及其與其它地區(qū)人群基因頻率的比較
　　在隨機輸血情

14、況下，F(xiàn)ya抗原不配合的幾率為0.1123，F(xiàn)yb抗原不配合的幾率為0.0044。二者合計不配合幾率為0.1167。在大連漢族人群，F(xiàn)Y*A基因頻率高達93.3％，遠(yuǎn)高于FY*B的基因頻率(6.7％)。大連漢族人群FY*A、FY*B的基因頻率分布與國內(nèi)其他地區(qū)漢族人群相比，無顯著性差異，但與浙江畬族相比，有顯著性差異(P=0.015)。
　　10.結(jié)直腸癌病例組和對照組DARC基因型分布的比較
　　在306例對照組人群中，基

15、因型FY*A/FY*A為266例，F(xiàn)Y*A/FY*B為39例。FY*B/FY*B為1例。在325例結(jié)直腸癌患者中，基因型FY*A/FY*A為286例，F(xiàn)Y*A/FY*B為38例。FY*B/FY*B為1例。尚未發(fā)現(xiàn)DARC基因型和結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。
　　11.DARC基因型和結(jié)直腸癌患者的病理特征的關(guān)系
　　在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組DARC的基因型FY*A/FY*B和FY*B/FY*B組合的基因型頻率(16.7％)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽

16、性組FY*A/FY*B和FY*B/FY*B組合的基因型頻率(8.6％)，而FY*A/FY*A的基因型頻率(83.3％)要低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的基因型頻率(91.4％)(P=0.026)?；蛐虵Y*A/FY*A的結(jié)直腸癌患者要比非FY*A/FY*A基因型的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險高2.137倍。
　　12.DARC基因型和紅細(xì)胞趨化因子清除功能的關(guān)系
　　DARC基因型FY*A/FY*A的紅細(xì)胞的CXCL8的清除能力要顯著低

17、于基因型FY*A/FY*B的紅細(xì)胞（P=0.016）。DARC基因型FY*A/FY*A的紅細(xì)胞的CCL2的清除能力要顯著低于基因型FY*A/FY*B的紅細(xì)胞(P=0.038)。
　　13.DARC基因型和紅細(xì)胞膜表面DARC表達的關(guān)系
　　基因型FY*A/FY*A的紅細(xì)胞表面DARC的表達水平明顯高于基因型FY*A/FY*B的紅細(xì)胞(P=0.021)。
　　結(jié)論:
　　1.DARC的表達在結(jié)直腸癌中是下調(diào)的，而這

18、個下調(diào)可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生進程。
　　2.DARC的表達是與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、MVD以及MMP-9呈負(fù)相關(guān)，而與腫瘤分化呈正相關(guān)。
　　3.DARC可能是通過降低微環(huán)境中促血管生成性趨化因子和MMP-9含量，抑制結(jié)直腸癌組織血管生成，進而抑制結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移。
　　4.DARC或許是結(jié)直腸癌生成、進展、血管生成以及轉(zhuǎn)移的負(fù)性調(diào)節(jié)因子以及潛在的預(yù)后指標(biāo)和分子治療靶點。
　　5.DARC的Taq

19、Man-MGB探針實時PCR基因分型方法具有快速、簡單、靈敏、重復(fù)性好、通量高、交叉污染風(fēng)險小等特點，而且實現(xiàn)了結(jié)果自動判讀，要優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR-ASP方法。
　　6.在大連漢族人群中，等位基因FY*A的基因頻率占優(yōu)勢，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FY*B。大連漢族人群DARC基因頻率分布特點和國內(nèi)其他地區(qū)漢族人群相似，但和畬族DARC基因頻率相比有顯著性差異，提示DARC等位基因分布具有民族差異。
　　7.在隨機輸血情況下，F(xiàn)ya和Fyb抗

20、原不配合的機率為0.1167。這提示在臨床輸血時，因Duffy血型不合引起的免疫反應(yīng)的風(fēng)險不容忽視。
　　8.DARC的rs12075位點基因多態(tài)性和結(jié)直腸癌的發(fā)生無關(guān)。
　　9.DARC的rs12075位點基因多態(tài)性和結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)。基因型FY*A/FY*A結(jié)直腸癌患者相對于非FY*A/FY*A患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　10.DARC的rs12075位點基因多態(tài)性影響紅細(xì)胞DARC的蛋白表