IL-17A對(duì)肺纖維化大鼠肺組織炎癥的調(diào)控研究.pdf

1、 目的：通過觀察經(jīng)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞(Alveolar macrophage,AM)中IL-17A的表達(dá),探討IL-17A在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用和意義。方法：1.取 20 只 Wistar 雌性大鼠(體重為180~200g)隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)和博萊霉素致肺纖維化模型實(shí)驗(yàn)組(BLM組),每組10只；2.BLM組：氣管內(nèi)一次性注入經(jīng)生理鹽水稀釋的博萊霉素溶液0.2ml(5mg/kg體重,BLM

2、溶液濃度為5mg/ml),用以誘導(dǎo)大鼠復(fù)制肺纖維化模型；NS組：氣管內(nèi)一次性注入0.2ml生理鹽水(1ml/kg體重)；3.然后各組分別于氣管內(nèi)灌注后第7天和第28天各隨機(jī)處死大鼠5只,無菌操作下行支氣管肺泡灌洗,回收支氣管肺泡灌洗液(Bronchial Alveolar Lavage Fluid,BALF),取出肺組織,病理學(xué)方法觀察各階段肺內(nèi)炎癥和纖維化程度,免疫組化檢測(cè)肺組織IL-17A表達(dá)。收集BALF分為兩組,一組用作細(xì)胞總、

3、分?jǐn)?shù)測(cè)定,以及用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA法)測(cè)定BALF中TNF-a、IL-17A的含量；一組用作AM的分離與純化、培養(yǎng),培養(yǎng)上清液用ELISA法測(cè)定IL-17A的含量,提取AM總RNA后用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)測(cè)定肺泡巨噬細(xì)胞IL-17A的mRNA表達(dá)。結(jié)果：1.肺組織病理切片觀察：NS組第7天及第28天均無肺泡炎及肺纖

4、維化表現(xiàn),肺組織結(jié)構(gòu)正常；BLM組第7天時(shí)主要表現(xiàn)為肺泡炎,BLM組第28天時(shí)主要表現(xiàn)為肺纖維化,但肺泡炎仍存在；2.BALF細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果分析：NS組BALF細(xì)胞總數(shù)無明顯變化,而BLM組BALF細(xì)胞總數(shù)第7天明顯增高,與NS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),第28天BALF細(xì)胞總數(shù)恢復(fù)至正常水平,與NS組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3.肺泡炎和肺纖維化分級(jí)計(jì)分的定量分析：NS組各時(shí)間點(diǎn)均未表現(xiàn)肺泡炎及肺纖

5、維化。BLM組肺泡炎程度在第7天表現(xiàn)顯著,與NS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),第 28 天時(shí)肺泡炎仍存在,但程度明顯減輕,與 NS組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BLM組肺纖維化程度在第7天表現(xiàn)中度,在第28天表現(xiàn)顯著,與NS組比較肺纖維化均加重,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.免疫組化肺組織IL-17A蛋白的分析：NS組大鼠肺組織中IL-17A表達(dá)弱,第7天及第28天均無明顯變化,而BLM組第7天及第28天

6、IL-17A表達(dá)較NS組比較明顯增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),第28天表達(dá)較第7天有所降低。5.ELISA檢測(cè)BALF中TNF-a、IL-17A顯示NS組大鼠BALF中的TNF-a、IL-17A含量無明顯變化,而BLM組第7天及第28天TNF-a、IL-17A含量明顯增高,與NS組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但第28天時(shí)TNF-a、IL-17A含量較第7天降低。6.ELISA檢測(cè)AM培養(yǎng)上清液中IL-17A顯

7、示NS組7天、28天AM各時(shí)期培養(yǎng)中呈弱表達(dá),各時(shí)期之間相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BLM組7天、28天AM培養(yǎng)第12小時(shí)、第24小時(shí)、第48小時(shí)上清液中IL-17A的表達(dá)與NS組比較均明顯增高,差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。7.RT-PCR檢測(cè)顯示IL-17A在NS組AM各時(shí)期培養(yǎng)中有微弱表達(dá),各時(shí)期之間相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BLM組7天、28天各時(shí)期的表達(dá)明顯高于NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

8、<0.05),尤以第12h顯著, 24h、48h表達(dá)逐漸減弱。8.相關(guān)分析：BALF中細(xì)胞總數(shù)、BALF中TNF-a含量、BALF中IL-17A含量、肺組織IL-17A蛋白的表達(dá)與肺泡炎程度積分呈正相關(guān)。BALF中TNF-a含量、BALF中IL-17A含量、肺組織IL-17A蛋白的表達(dá)三者之間呈正相關(guān)。第7天時(shí)BALF中TNF-a含量、BALF中IL-17A含量、肺組織IL-17A蛋白的表達(dá)分別與BALF中性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)；而第28天