心內(nèi)膜下移植骨髓單個核細胞和間充質(zhì)干細胞對豬急性心肌梗死療效的實驗研究.pdf

1、背景：
　　心肌梗死發(fā)生后,由于心臟的再生能力極其有限,靠心肌自身的修復機制遠遠不能彌補因缺血損傷造成的心肌細胞的損失,殘存心肌的代償性肥大以及梗死心肌的纖維化使許多患者最終不可避免的發(fā)展成為心力衰竭。藥物治療和冠狀動脈血管成形術的飛速發(fā)展雖然有效降低了心肌梗死病人的早期死亡率,改善了患者的生活質(zhì)量,卻不能從根本上解決心肌細胞損失的問題,因此很多病人的預后并不理想。心臟移植作為一種終末治療手段,也受到免疫排斥、供體不足、高死亡率、

2、費用昂貴等諸多因素的限制。
　　干細胞是一類具有多向分化潛能和自我復制能力的原始的未分化細胞,是形成哺乳類動物各組織器官的原始細胞,它的出現(xiàn)為心肌損傷的治療帶來了新的希望。目前干細胞心肌再生研究已經(jīng)成為探討心肌損傷治療策略的熱點。研究表明,干細胞可以通過多種方式發(fā)揮修復損傷心肌的治療作用。對多種干細胞的基礎、臨床前及臨床研究已經(jīng)證實了干細胞治療對心臟損傷的安全性和有效性,其中部分已經(jīng)完成了Ⅲ期臨床試驗。
　　但干細胞治療仍然

3、有許多問題未解決,如機制還不十分明確,細胞在體內(nèi)的存留和植入效率極低,最佳細胞類型、最佳細胞劑量、最佳輸注途徑及最佳輸注時機等仍不清楚,而最直接、首先需要解決的問題則是選擇合適的細胞類型,以最佳途徑輸送到目標區(qū)域,由于各個研究的實驗設計和操作技術存在很大差別,使不同種類細胞之間的療效的比較十分困難,因此,我們設計了這個實驗,對骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)和間充質(zhì)干細胞(Mes

4、enchymal stem cells,MSCs)對急性心肌梗死的療效進行頭對頭的比較。
　　目的：
　　1、探索經(jīng)皮心內(nèi)膜下心肌注射技術治療大動物急性心肌梗死方法;
　　2、比較心肌內(nèi)BMMNCs和MSCs的移植,對大動物急性心肌梗死的療效;
　　3、進一步觀察BMMNCs和MSCs在治療大動物急性心肌梗死中可能的機制。
　　方法：
　　1、實驗用小型豬髂后上嵴穿刺抽取骨髓,密度梯度離心法分離單個核

5、細胞,再體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞,應用流式細胞術和多向分化能力對間充質(zhì)干細胞進行鑒定,應用CM-DiI及GFP分別對骨髓單個核細胞及間充質(zhì)干細胞進行標記;
　　2、30只實驗用小型豬隨機分為3組,每組10只。通過臨床心導管技術,應用球囊封堵小型豬左冠狀動脈前降支建立小型豬急性心肌梗死模型;
　　3、制備模型2周后,將標記過的骨髓單個核細胞、間充質(zhì)干細胞及培養(yǎng)液通過心肌注射器經(jīng)導管進行心內(nèi)膜下心肌內(nèi)注射;
　　4、通過經(jīng)胸超

6、聲心動圖及SPECT對小型豬細胞治療后的心臟功能及組織灌注進行觀察,隨訪8周;
　　5、心肌梗死10周后處死動物,取組織熒光顯微鏡下觀察細胞的植入,免疫熒光染色檢測植入細胞的分化;
　　6、CD31免疫熒光染色觀察梗死心肌的新生血管;
　　7、天狼星紅染色并偏振光顯微鏡下觀察心肌纖維化及膠原形成情況;
　　8、Western-Blot檢測梗死心肌內(nèi)的MMP表達水平。
　　結果：
　　1、成功從小型豬骨

7、髓中分離培養(yǎng)出了豬骨髓單個核細胞及間充質(zhì)干細胞,并進行了鑒定及熒光標記;
　　2、共計30只小型豬接受模型制備,制備過程中死亡8只,其余22只均存活至實驗結束,并接受了細胞或培養(yǎng)液注射及超聲心動圖和SPECT檢查;其中MSCs組8只,其余兩組每組7只;
　　3、10周時,經(jīng)胸超聲心動圖結果顯示,三組之間的左室射血分數(shù)(LVEF)、左室收縮末容積(LVESV)、左室舒張末容積(LVEDV)均無明顯差異(LVEF:MSCs組51

8、±8.3％,BMMNCs組50±6.2%,CON組48±7.3%,p>0.05),與細胞注射前相比,MSCs組及BMMNCs組的LVEF雖然有所增加,但差異不具有顯著性(p>0.05)。心梗10周時,MSCs組的室壁運動分數(shù)(WMSI)較2周時明顯改善(1.96±0.24 vs2.35±0.21,p<0.05),而BMMNCs組及CON組則無明顯改善。10周時三組之間的WMSI無明顯差異(p>0.05)。心梗10周時,僅MSCs組的室壁

9、增厚率(WT%)較2周時明顯改善(27±4.4%vs18±3.7%,p<0.05),且10周時MSCs組的WT%明顯優(yōu)于BMMNCs組及CON組(27±4.4%vs20±2.1%,18±2.9%,p<0.05);
　　4、10周時,SPECT結果顯示,細胞移植8周即心肌梗死10周后,CON組的灌注缺損沒有明顯改變,MSCs及BMMNCs治療均顯著減小了梗死心臟的灌注缺損(MSCs:21.7±3.0%vs29.6±5.1%,p<0.

10、05;BMMNCs:22.9±3.7%vs29.4±5.6%,p<0.05)。且心梗10周時MSCs及BMMNCs治療組的灌注缺損顯著小于CON組(21.7±3.0%,22.9±3.7%vs30.0±5.8%,p<0.05)。MSCs組及BMMNCs組治療后灌注缺損的絕對改變也顯著優(yōu)于 CON組(-8.0±2.5%,-6.5±1.9% vs.-2.0±1.3%,p<0.05);
　　5、組織CD31免疫熒光染色結果顯示,10周時,

11、 MSCs組及BMMNCs組心臟梗死周邊組織的新生血管密度明顯高于CON組(16.2±4.1%,14.0±3.4%vs.7.8±2.8%,p<0.05);
　　6、組織天狼星紅染色及偏振光顯微鏡檢查結果顯示,MSCs組的缺血區(qū)組織內(nèi)膠原含量明顯低于BMMNCs組和CON組(55.4±6.5% vs63.6±7.8%,67.4±7.2%,p<0.05);
　　7、Western-Blot檢測結果顯示,MSCs組梗死周圍組織內(nèi)的

12、MMP-2表達水平明顯低于BMMNCs組和CON組(p<0.05),三組的MMP-9表達水平無明顯差異。
　　結論
　　1、本實驗建立了經(jīng)皮心內(nèi)膜下心肌內(nèi)注射干細胞,治療大動物心肌梗死的方法,確認了其可行性;
　　2、發(fā)現(xiàn)BMMNCs和MSCs均可改善心肌灌注,相比BMMNCs,MSCs可提高左室局部收縮功能;
　　3、MSCs對心肌損傷的修復作用優(yōu)于BMMNCs,治療效果的差異可能與MSC抑制梗死后心肌的纖維化