microRNA194在腹透流出液培養(yǎng)的腹膜間皮細胞中的表達及與EMT的關(guān)系.pdf

1、背景:持續(xù)不臥床腹膜透析(Continuous ambulatory peritonealdialysis,CAPD)是終末期腎臟疾病(End-stage renal disease,ESRD)的治療方法之一。腹膜纖維化(Peritoneal fibrosis,PF)是各種原因引起腹膜病理改變的最終結(jié)果。在長期接受CAPD的過程中,腹膜長期暴露在生物不相容性的腹透液中,導(dǎo)致了腹膜間皮細胞剝脫,最終發(fā)生腹膜纖維化和超濾衰竭(Ultrafi

2、ltration failure,UFF)。腹膜間皮細胞(Peritoneal mesothelial cells,PMCs)被認為是引起纖維化的主要細胞,研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)可能是肌成纖維細胞的重要來源之一,最近研究進一步證明EMT是腹膜纖維化的起始環(huán)節(jié),但具體的機制仍還不太清楚。microRNA(miRNA)是存在于動植物基因組中的功

3、能性非編碼RNA,可通過誘導(dǎo)靶mRNA的切割降解和抑制基因翻譯,調(diào)控相關(guān)基因的表達。最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與TGF-β誘導(dǎo)的細胞EMT形成。但miRNA在腹膜間皮細胞上的表達以及在腹膜EMT和纖維化中的作用國內(nèi)外尚未見報道。目的:探討腹透流出液中培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的改變以及miRNA194的表達,并分析其與EMT的相關(guān)性。
　　方法:(1)取中南大學(xué)附屬湘雅二醫(yī)院及湘雅三醫(yī)院腹膜透析中心的CAPD患者,按腹透時間分為兩組

4、:①新開管組②腹透一年以上組,取其夜間留腹腹透液分離培養(yǎng)人的腹膜間皮細胞,培養(yǎng)十四天后經(jīng)倒置相差顯微鏡和免疫組化染色(Immunohistochemistry,HIS)鑒定,原代細胞用于實驗;(2)采用實時熒光定量PCR中的Taqman熒光探針法檢測miRNA194在上述兩組腹膜間皮細胞中的表達;(3)分別用Westem-blot、real time PCR法觀察α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)蛋白

5、和mRNA的表達;(4)分析miRNA194表達以及與α-SMA和E-cadherin表達的相關(guān)性。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)鑒定,腹透流出液中培養(yǎng)的細胞95％以上為人腹膜間皮細胞(HPMCs)。(2)相差倒置顯微鏡觀察新開管的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs形態(tài)上一小部分呈圓形,橢圓形的上皮樣細胞,融合后呈鋪路石狀,與大網(wǎng)膜培養(yǎng)的腹膜間皮細胞相似;而大部分為上皮樣細胞和梭形的纖維樣細胞的混合存在;腹透一年以上的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPM

6、Cs多為梭形的纖維樣細胞。(3)Realtime PCR Taqman熒光探針法顯示miRNAl94在腹膜間皮細胞中有表達,并且腹透一年以上的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs的表達水平明顯高于新開管組患者的(P<0.05)。(4)Real time PCR顯示腹透一年以上的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs E-cadherin mRNA表達水平明顯低于新開管組患者的(P<0.05);腹透一年以上的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCsα-SMA m

7、RNA表達水平明顯高于新開管組患者的(P<0.05)。Westem-blot顯示腹透一年以上的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs E-cadherin蛋白表達水平比新開管患者的表達水平下調(diào)(P<0.05);腹透一年以上的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCsα-SMA蛋白表達水平比新開管患者的表達水平上調(diào)(P<0.05)。(5)新開管和腹透一年以上患者的腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs miRNA194表達與E-cadherin mRNA表達呈負相關(guān),相

8、關(guān)系數(shù)r=-0.952;miRNA194表達與α-SMA mRNA表達呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.760,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:(1)miRNA194在腹透流出液中培養(yǎng)的HPMCs上有表達,并且miRNA194的表達隨著腹透時間的延長明顯增加。(2)腹透一年以上患者的腹透流出液中培養(yǎng)的HPMCs上的EMT相關(guān)分子標記物E-cadherin和α-SMA表達較新開管患者的明顯異常,提示隨著腹透時間的延長,腹透流出液