尿胞外體在糖尿病腎病中的作用研究.pdf

1、背景
　　 糖尿病腎病(diabetickidneydisease，DKD)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，并且是引起終末期腎病(endstageofrenaldiseases，ESRD)最常見的原因。糖尿病腎病的臨床分期如下:Ⅰ期:正常蛋白尿期，尿白蛋白/肌酐比率(urinaryalbumin/creatinineratio，UACR)＜30mg/g肌酐;Ⅱ期:微量蛋白尿期，UACR在30-300mg/g肌酐;Ⅲ期大量蛋白尿期

2、，UACR≧300mg/g肌酐或者伴隨持續(xù)蛋白尿伴血肌酐濃度＜1.2mg/dl;Ⅳ期:慢性腎功能衰竭，血肌酐濃度≧1.2mg/dl伴蛋白尿;Ⅴ期:慢性透析治療。
　　 以往有人認(rèn)為糖尿病腎病是一個單方向的過程，一旦發(fā)生微量白蛋白尿就直接發(fā)展為終末期腎病。但最近的研究表明，有些已被診斷為糖尿病腎病的患者又恢復(fù)到正常蛋白尿狀態(tài)，即使在微量蛋白尿階段，有三分之一的糖尿病腎病患者失去了腎功能。因此，在診斷糖尿病腎病時，需要更靈敏更有特異

3、性的標(biāo)志物。
　　 尿液對尋找診斷性標(biāo)志物的研究是最有用的實(shí)驗(yàn)材料。因?yàn)樗子趶幕颊咛帿@得，收集過程十分方便并且為非侵入性。除了可溶性的血漿蛋白，尿液中的微囊泡，如胞外體和微粒，最近成為了尿液蛋白分析的靶點(diǎn)。尿液胞外體(exosome)是一種由小管細(xì)胞分泌的直徑為40-100nm的膜性囊泡，而微粒是一種無膜結(jié)構(gòu)的大小在100-1000nm的微泡。胞外體和微粒均以同樣的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)為特點(diǎn)，而大部分從尿液中分離的微囊泡被認(rèn)為是胞外體

4、。有報道證實(shí)了水通道蛋白-2僅僅存在于尿液胞外體中，而其他來源的胞外體中沒有。這些胞外體可能為腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷提供理想的生物標(biāo)志物。
　　 已有報道表明二肽基肽酶-4（dipeptidylpeptidase-4，DPP4，即CD26）與糖尿病有密切的關(guān)系。DPP4是一種膜相關(guān)蛋白，在所有組織中廣泛的表達(dá)，其在腎臟異位聚集，主要位于皮質(zhì)、刷狀緣和微絨毛碎片中。DPP4可降解活性胰高血糖素樣肽-1（glucagon-likepep

5、tide-1，GLP-1），GLP-1是餐后由小腸L細(xì)胞分泌的腸降血糖素，可以通過葡萄糖依賴的途徑增加胰島素分泌。DPP4抑制劑沙格列汀和西格列汀已被批準(zhǔn)用于2型糖尿病患者飲食和運(yùn)動控制不佳的治療。我們推測DPP4是尿液胞外體的組成成分，尿液中的胞外體濃度也許反映腎小管上皮細(xì)胞的損傷。我們用胞外體特異性特異性抗體(AD-1)和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測尿液胞外體中的D

6、PP4。AD-1固定在板上后，這種抗體可以特異性捕獲及純化尿液中完整的胞外體，同時胞外體中DPP4的活性可以被測定。通過這種方法，我們測定了2型糖尿病患者尿液中的胞外體結(jié)合的DPP4活性，并且與年齡和性別匹配的正常個體進(jìn)行對比。我們推測不同個體尿液樣本的水合狀態(tài)也許會導(dǎo)致尿液水/鹽含量的不同，從而留取了24h尿，然后將其中的一部分用于我們的分析。我們評價胞外體結(jié)合的DPP4用作糖尿病腎病早期的生物標(biāo)志物的效果。
　　 目的

7、>　　 1.證實(shí)糖尿病腎病患者血液及尿液中存在胞外體。
　　 2.尿胞外體結(jié)合的DPP4在正常人、糖尿病患者、糖尿病腎病微量白蛋白尿患者、糖尿病腎病大量白蛋白尿患者中的變化。
　　 方法
　　 1.選取127例2型糖尿病患者，根據(jù)24h尿白蛋白肌酐比分為糖尿病正常白蛋白尿組（DM，43例），微量白蛋白尿組（DN1，50例），大量白蛋白尿組（DN2，34例）。健康對照組34例。
　　 2.采用特異性的單克

8、隆抗體提純胞外體，并驗(yàn)證抗體特異性，使用電鏡對胞外體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附法檢測尿液exosome-DPP4的水平及血exosome-DPP4水平，濾過離心的方法檢測尿游離DPP4水平，使用WesternBlot方法對胞外體進(jìn)行分子標(biāo)記物鑒定。
　　 4.同時檢測糖化血紅蛋白（液相色譜法）、血膽固醇（化學(xué)修飾法）、肌酐（苦味酸法）、尿素氮（速率法），尿白蛋白的測定由芬蘭Quickread101分析儀完成

9、，結(jié)果采用UACR報告。
　　 5.應(yīng)用逐步多元回歸方法分析DPP4與糖化血紅蛋白、血膽固醇、肌酐、尿素氮、UACR相關(guān)性。
　　 結(jié)果
　　 1.血和尿中均存在胞外體，其形態(tài)是脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。
　　 2.血、尿的DPP4同源，尿exosome-DPP4是尿中DPP4的主要存在形式。
　　 3.DM、DN1、DN2組尿exosome-DPP4水平均顯著高于正常組(均P＜0.01)，尿exosome