RANKL基因沉默對(duì)MG63細(xì)胞功能的影響及機(jī)制初探.pdf

1、核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofNF-κBligand，RANKL)從屬于腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)超家族，是一種表達(dá)于成骨細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面的膜蛋白，對(duì)于T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和破骨細(xì)胞的發(fā)育及功能具有重要的作用，其中破骨細(xì)胞的分化對(duì)于RANKL的表達(dá)呈現(xiàn)出絕對(duì)的依賴性。研究表明，骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)/RANKL/核因子

2、κB受體活化因子(receptoractivatorofNF-κB，RANK)信號(hào)通路為闡明骨代謝疾病的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，OPG和RANK均通過(guò)與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)，因此RANKL在該骨代謝軸中起樞紐作用。 TNF超家族的絕大多數(shù)成員可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有研究顯示，RANKL抑制單核細(xì)胞RAW264.7的增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因cyclinD1，cyclinD3，

3、cyclinE，上調(diào)cyclin依賴的激酶抑制劑p27有關(guān)。但RANKL對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)，其最大潛能在于它可以在短時(shí)間內(nèi)關(guān)閉幾乎每一個(gè)特定的基因，因此適用于基因功能、藥物靶基因篩選及藥物靶點(diǎn)的驗(yàn)證，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療的研究。

4、目前，采用靶向的RNAi技術(shù)來(lái)研究RANKL基因功能及探索相關(guān)的骨代謝疾病的發(fā)病機(jī)制和基因治療，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)研究報(bào)道。保留人成骨細(xì)胞表型特征的MG63細(xì)胞株，近年被廣泛應(yīng)用于骨代謝疾病的研究。因此，本研究擬利用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，從RANKL信號(hào)分子入手，設(shè)計(jì)靶向RANKL的短發(fā)夾RNA(smallhairpininterferenceRNA，shRNA)，構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)載體(RNAinter

5、ferenceusingalentivirus-basedsmallhairpinRNA，vshRNA)，轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63，建立細(xì)胞感染模型；通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)RANKLmRNA及其蛋白表達(dá)水平，評(píng)價(jià)介導(dǎo)的RNAi對(duì)信號(hào)分子基因表達(dá)的沉默作用；動(dòng)態(tài)觀察MG63細(xì)胞功能的變化(包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)指標(biāo)、細(xì)胞內(nèi)OPGmRNA的表達(dá))，并研究與細(xì)胞功能相關(guān)基因p53、c

6、yclinD1、survivinmRNA表達(dá)的改變，探究RANKL基因?qū)G63細(xì)胞功能的影響及相關(guān)機(jī)制。 研究目標(biāo): 總體目標(biāo)：靶向RANKL基因慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建，純化和篩選，并轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63，建立細(xì)胞模型；研究該慢病毒載體系統(tǒng)對(duì)目的細(xì)胞RANKLmRNA含量及蛋白表達(dá)的影響；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)細(xì)胞功能指標(biāo)及相關(guān)基因(p53、cyclinD1、survivinmRNA)表達(dá)水平的分析，初步探索RANKL基

7、因沉默對(duì)MG63細(xì)胞功能的影響及可能機(jī)制。包括： 1.RANKL基因RNA干擾慢病毒載體的設(shè)計(jì)、制備和包裝，獲得靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒重組載體系統(tǒng)； 2.重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63，建立細(xì)胞模型； 3.通過(guò)WesternBlot和RealtimePCR分析，研究vshRNA慢病毒重組載體對(duì)MG63細(xì)胞RANKL基因表達(dá)的抑制作用； 4.通過(guò)分析細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期、細(xì)胞堿性磷酸酶

8、(ALP)活力、細(xì)胞內(nèi)OPGmRNA的表達(dá)，研究RANKL基因?qū)G63細(xì)胞功能的影響； 5.通過(guò)細(xì)胞內(nèi)p53、cyclinD1、survivinmRNA表達(dá)改變的研究，探索RANKL基因敲減后MG63細(xì)胞功能變化的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容和方法第1章靶向RANKL基因的shRNA慢病毒重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建目的旨在設(shè)計(jì)、構(gòu)建目的基因RANKL的RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 針對(duì)RANKL靶基因序列，利用Ambion網(wǎng)站按照RNA干擾序

9、列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，選擇最佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究?jī)?nèi)容包括：合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo(具有嚴(yán)格的檢測(cè)體系，PAGE純化體系)，其兩端含酶切位點(diǎn)粘端，直接連入酶切后的RNA干擾載體上；將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定；在進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后，鑒定陽(yáng)性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 第2章靶向RANKL基因vshRNA慢病毒重組載體的

10、制備及病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立合成靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒載體系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63，建立細(xì)胞模型。 研究?jī)?nèi)容包括：制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度：獲得的病毒顆粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞MG63，以建立細(xì)胞模型。 第3章vshRNA慢病毒重組載體對(duì)MG63細(xì)胞RANKL基

11、因抑制作用的研究通過(guò)Westernblot和RT-PCR研究其對(duì)于人成骨樣細(xì)胞MG63RANKL蛋白含量和基因表達(dá)的影響。 研究?jī)?nèi)容包括：培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞(即MG63細(xì)胞)，感染當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組情況加入不同MOI(multipulyofinfection)的RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)；感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP/RFP表達(dá)情況，5天后采用Westernblot和RT-PCR的方法檢測(cè)MG63細(xì)胞

12、內(nèi)RNAKL蛋白和mRNA的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果。Real-timePCR數(shù)值分析采用2-△△Ct分析法；制圖軟件：GraphPadPRISM4.0。 第4章RANKL基因沉默對(duì)MG63細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞ALP活力及OPGmRNA的表達(dá)水平，觀察RANKL基因沉默對(duì)MG63細(xì)胞功能的影響。 4.1細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置組別，分別為空白

13、對(duì)照組(CON)、陰性病毒對(duì)照組(NC)和RANKL-vshRNA感染組(KD)，每組各3個(gè)復(fù)孔。分別取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(是指病毒感染靶細(xì)胞后第5天開(kāi)始接種細(xì)胞，檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)是其后連續(xù)的1、2、3、4天)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，通過(guò)OD值反映細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)情況。 4.2細(xì)胞周期根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置組別，分別為CON組、NC組和KD組，每組各3個(gè)復(fù)孔。利用pGCL-GFEretro-3病毒感染MG63細(xì)胞，5天后開(kāi)始接種細(xì)胞，利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠

14、和PI熒光染料結(jié)合的特性，細(xì)胞各個(gè)時(shí)期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)熒光度確定各個(gè)時(shí)期細(xì)胞所占比例。 4.3細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活力根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置組別，分別為CON、NC和KD，每組各3個(gè)復(fù)孔。分別取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(是指病毒感染靶細(xì)胞后第5天開(kāi)始接種細(xì)胞，檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)是其后連續(xù)的1、2、3、4天)，進(jìn)行ALP活力的測(cè)定。 4.4細(xì)胞OPGmRNA含量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置組別，

15、分別為CON組、NC組和KD組，每組各3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，感染當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組別加入RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)。感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，感染5天后收集細(xì)胞。采用RT-PCR的方法檢測(cè)OPGmRNA表達(dá)情況。 4.5結(jié)果統(tǒng)計(jì)采用軟件SPSS12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用MicrosoftExcel進(jìn)行作圖處理。Real-timePCR數(shù)

16、值分析采用2-△△Ct分析法，制圖軟件為GraphPadPRISM4.0。 第5章RANKL基因沉默對(duì)NG63細(xì)胞功能影響的機(jī)制初探在以上研究的基礎(chǔ)上，利用該病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞功能相關(guān)基因p53、survivin及cyclinD1mRNA的表達(dá)水平。 Real-timePCR檢測(cè)p53、survivin及cyclinD1基因mRNA的表達(dá)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置組別，分別為CON組、NC組和KD組，每組各