二膦酸鹽對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)及OPG-RANKL表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外實(shí)驗(yàn)觀察二膦酸鹽對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡，探討在一定時(shí)間范圍內(nèi)，二膦酸鹽誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的最適作用濃度。分析二膦酸鹽對(duì)細(xì)胞內(nèi)骨保護(hù)素OPG、RANKL在基因和蛋白水平表達(dá)上的影響，初步探討二膦酸鹽對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞作用可能機(jī)制。　　方法：1.將濃度分別為0.3、1、3、10、30、100、300、1000μmol/L二膦酸鹽藥物干預(yù)人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63作用24h、48h、72h，采用M

2、TT比色法測(cè)定其細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度； 2.形態(tài)學(xué)觀察：熒光染色法，采用Hoechst33258細(xì)胞染色法觀察二膦酸鹽藥物干預(yù)后的骨肉瘤細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察早期、晚期凋亡細(xì)胞的形態(tài)。透射電鏡下觀察作用后早、晚期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)形態(tài)； 3.采用碘化丙啶(PI)染色藥物作用后的骨肉瘤細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例及細(xì)胞周期，F(xiàn)CM進(jìn)行細(xì)胞周期分析及凋亡率檢測(cè)；

3、4.采用RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)OPG、RANKL在mRNA水平和蛋白水平的變化。 結(jié)果：1.二膦酸鹽藥物作用于人骨肉瘤細(xì)胞株24h、48h、72h后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，生長(zhǎng)抑制曲線表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，與對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈現(xiàn)藥物濃度和時(shí)間依賴性。MTT比色法測(cè)得藥物作用72h對(duì)MG-63細(xì)胞的ID50為52.37±1.0μmol/L，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組確t驗(yàn)分析t=2.

4、201，P<0.01； 2.二膦酸鹽濃度為50μmol/L作用于骨肉瘤細(xì)胞株72h后，經(jīng)Hoechst33258細(xì)胞染色熒光顯微鏡下可見早期凋亡細(xì)胞，隨著作用濃度和時(shí)間增加，早期凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，并出現(xiàn)晚期凋亡細(xì)胞，透射電鏡證實(shí)其對(duì)細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)改變； 3.細(xì)胞周期分析二膦酸鹽對(duì)G1期細(xì)胞阻滯，實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞比例(7.13±0.91)％，相比對(duì)照組(32.15±2.31)％，P<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二膦酸鹽50

5、μmol/L作用24、48、72h的MG-63細(xì)胞，經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色72h后細(xì)胞凋亡率(40.2±2.1)％相比對(duì)照組細(xì)胞(2.84±0.7)％有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01； 4.RT-PCR產(chǎn)物擴(kuò)增出條帶位置，與預(yù)期條帶一致。在486bp大小片段處RANKL表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無明顯差異；相反OPG的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加，經(jīng)光密度分析，OPG表達(dá)增加是對(duì)照組1.8倍；Western印跡檢測(cè)結(jié)果

6、示，當(dāng)二膦酸鹽濃度為0.1～10μmol/L時(shí)印跡有明顯條帶，蛋白表達(dá)逐步上調(diào)，經(jīng)光密度分析，實(shí)驗(yàn)組隨著藥物濃度增加OPG蛋白表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：1.二膦酸鹽對(duì)體外培養(yǎng)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖數(shù)量與藥物濃度及時(shí)間有顯著依賴性； 2.體外實(shí)驗(yàn)研究表明二膦酸鹽可明顯誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞阻滯在G1期； 3.體外實(shí)驗(yàn)探索了二膦酸鹽對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)OPG、RANKL表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)其在mRNA水平和蛋