富集文庫法開發(fā)甜葉菊微衛(wèi)星分子標記.pdf

1、甜葉菊是一種低熱值、高甜度的新興經濟作物，其應用價值得到人們的廣泛關注?，F(xiàn)今分子標記已應用在各種作物的遺傳分析領域，而甜葉菊的分子生物學研究剛剛起步。
　　本文探討了甜葉菊微衛(wèi)星富集文庫的構建，成功開發(fā)了甜葉菊微衛(wèi)星標記，并對所開發(fā)出微衛(wèi)星標記的通用性進行檢測。具體研究結果如下:
　　1.微衛(wèi)星文庫構建:利用表現(xiàn)性狀優(yōu)良的甜葉菊品種構建甜葉菊微衛(wèi)星富集文庫。利用限制性內切酶Sau3AⅠ酶切基因組，以生物素標記的(AT)15、

2、(AC)15、(AG)15、(GAT)12微衛(wèi)星探針，通過磁珠富集法構建了4個微衛(wèi)星富集文庫。除微衛(wèi)星探針(AT)15由于雜交溫度較低，無法成功構建富集文庫外，其它3個微衛(wèi)星探針都成功建成微衛(wèi)星富集文庫。從3個富集文庫中共得到809個克隆，運用兩次引物篩選法篩選克隆后，對篩選得到的392個克隆進行測序，共獲得含有微衛(wèi)星序列的克隆269個。對含有微衛(wèi)星的序列進行類型統(tǒng)計，并設計微衛(wèi)星引物，最終設計得到177對微衛(wèi)星引物。
　　2.引

3、物多態(tài)性檢測:運用甜葉菊品系177-11對開發(fā)得到的177對微衛(wèi)星引物進行引物穩(wěn)定性的檢測，其中有152條引物可得到穩(wěn)定的擴增條帶。通過24個甜葉菊品系對能擴增出條帶的引物進行多態(tài)性檢測，篩選得到56對具有多態(tài)性的引物，總共檢測到190個等位基因變異，每個位點的等位基因數(shù)在2～8個不等，平均每個位點的等位基因為3.39個。分析發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性信息含量(PIC)值在0.0763～0.7595之間，平均為0.4542;觀測雜合度(Ho)在0.2

4、154～0.9167之間，期望雜合度(He)在0.1197～0.8076之間，總體上篩選得到的多態(tài)性標記有良好的多態(tài)性。
　　3.品系遺傳多樣性分析:通過聚類圖發(fā)現(xiàn)，以遺傳相似系數(shù)0.68為閾值，可將24份甜葉菊品種分為兩大類，基本上是按照葉型進行區(qū)分的。同時，按照材料中總糖甙含量（total glycoside，TG）以及瑞鮑迪甙A（rebaudiosideA，RA）和甜菊甙(stevioside，ST)的不同，可將全部供試材料

5、分成TG類與RA和ST兩大類型。
　　4.微衛(wèi)星標記擴增物種通用性檢測:用與甜葉菊同科的6種蔬菜，對甜葉菊中開發(fā)得到56對具有多態(tài)性的引物進行PCR擴增，檢測發(fā)現(xiàn)僅有15條引物能夠擴增出條帶，但擴增出的條帶都無多態(tài)性表現(xiàn)，且條帶大多較為模糊。由此可見，盡管可以從近緣物種中獲得通用性引物，但由于很多近緣物種微衛(wèi)星無法穩(wěn)定擴增，在通用性方面相對有限，而本研究從甜葉菊開發(fā)出的微衛(wèi)星標記，雖然6種蔬菜與甜葉菊同屬一個科，但親緣關系較遠，加