富集文庫法開發(fā)甜葉菊微衛(wèi)星分子標(biāo)記.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、甜葉菊是一種低熱值、高甜度的新興經(jīng)濟(jì)作物,其應(yīng)用價(jià)值得到人們的廣泛關(guān)注?,F(xiàn)今分子標(biāo)記已應(yīng)用在各種作物的遺傳分析領(lǐng)域,而甜葉菊的分子生物學(xué)研究剛剛起步。
  本文探討了甜葉菊微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建,成功開發(fā)了甜葉菊微衛(wèi)星標(biāo)記,并對所開發(fā)出微衛(wèi)星標(biāo)記的通用性進(jìn)行檢測。具體研究結(jié)果如下:
  1.微衛(wèi)星文庫構(gòu)建:利用表現(xiàn)性狀優(yōu)良的甜葉菊品種構(gòu)建甜葉菊微衛(wèi)星富集文庫。利用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ酶切基因組,以生物素標(biāo)記的(AT)15、

2、(AC)15、(AG)15、(GAT)12微衛(wèi)星探針,通過磁珠富集法構(gòu)建了4個(gè)微衛(wèi)星富集文庫。除微衛(wèi)星探針(AT)15由于雜交溫度較低,無法成功構(gòu)建富集文庫外,其它3個(gè)微衛(wèi)星探針都成功建成微衛(wèi)星富集文庫。從3個(gè)富集文庫中共得到809個(gè)克隆,運(yùn)用兩次引物篩選法篩選克隆后,對篩選得到的392個(gè)克隆進(jìn)行測序,共獲得含有微衛(wèi)星序列的克隆269個(gè)。對含有微衛(wèi)星的序列進(jìn)行類型統(tǒng)計(jì),并設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物,最終設(shè)計(jì)得到177對微衛(wèi)星引物。
  2.引

3、物多態(tài)性檢測:運(yùn)用甜葉菊品系177-11對開發(fā)得到的177對微衛(wèi)星引物進(jìn)行引物穩(wěn)定性的檢測,其中有152條引物可得到穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶。通過24個(gè)甜葉菊品系對能擴(kuò)增出條帶的引物進(jìn)行多態(tài)性檢測,篩選得到56對具有多態(tài)性的引物,總共檢測到190個(gè)等位基因變異,每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)在2~8個(gè)不等,平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?.39個(gè)。分析發(fā)現(xiàn),多態(tài)性信息含量(PIC)值在0.0763~0.7595之間,平均為0.4542;觀測雜合度(Ho)在0.2

4、154~0.9167之間,期望雜合度(He)在0.1197~0.8076之間,總體上篩選得到的多態(tài)性標(biāo)記有良好的多態(tài)性。
  3.品系遺傳多樣性分析:通過聚類圖發(fā)現(xiàn),以遺傳相似系數(shù)0.68為閾值,可將24份甜葉菊品種分為兩大類,基本上是按照葉型進(jìn)行區(qū)分的。同時(shí),按照材料中總糖甙含量(total glycoside,TG)以及瑞鮑迪甙A(rebaudiosideA,RA)和甜菊甙(stevioside,ST)的不同,可將全部供試材料

5、分成TG類與RA和ST兩大類型。
  4.微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增物種通用性檢測:用與甜葉菊同科的6種蔬菜,對甜葉菊中開發(fā)得到56對具有多態(tài)性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測發(fā)現(xiàn)僅有15條引物能夠擴(kuò)增出條帶,但擴(kuò)增出的條帶都無多態(tài)性表現(xiàn),且條帶大多較為模糊。由此可見,盡管可以從近緣物種中獲得通用性引物,但由于很多近緣物種微衛(wèi)星無法穩(wěn)定擴(kuò)增,在通用性方面相對有限,而本研究從甜葉菊開發(fā)出的微衛(wèi)星標(biāo)記,雖然6種蔬菜與甜葉菊同屬一個(gè)科,但親緣關(guān)系較遠(yuǎn),加

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