擬穴青蟹微衛(wèi)星標記開發(fā)及應(yīng)用研究.pdf

1、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亞目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla)，廣泛分布于印度-西太平洋沿岸水域，在我國主要分布于東南沿海水域。近年來擬穴青蟹養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，對擬穴青蟹苗種的需求量也越來越大，優(yōu)良品種的選育就顯得尤為重要。遺傳多樣性的高低是由遺傳變異的多少和群體遺傳結(jié)構(gòu)決定的，它與物種的進化潛力和耐

2、受不良環(huán)境的能力息息相關(guān)。因此，研究遺傳多樣性對于物種保護、維持生態(tài)環(huán)境平衡等具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本研究采用5’錨定PCR技術(shù)開發(fā)擬穴青蟹微衛(wèi)星標記，根據(jù)自行分離的微衛(wèi)星序列獲得多態(tài)性引物18對，并以中國東南沿海擬穴青蟹11個地理群體和6個家系群體為實驗材料，分別對擬穴青蟹野生群體和家系群體進行遺傳多樣性分析。獲得的實驗結(jié)果如下：
　　 1、設(shè)計5’錨定引物3對，以擬穴青蟹基因組DNA為模板進行擴增，然后回收片段大小在

3、250～750bp的片段進行克隆測序。挑取單克隆247個，其中220個克隆包含插入序列，占全部克隆數(shù)的89.07％。選取144個克隆測序，其中共有112條序列在序列兩端或/和中間存在串聯(lián)重復(fù)序列(77.78％)。根據(jù)測得的序列利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物90對，其中18對引物的擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后條帶清晰可見，且表現(xiàn)出多態(tài)性。18個微衛(wèi)星位點的觀測等位基因數(shù)Na在5～9之間，平均每個位點6.9個，有效等

4、位基因數(shù)Ne在1.7～7.3之間，平均每個位點4.3個；等位基因大小在166～316bp之間。觀測雜合度HO和期望雜合度HE分別在0.33～0.92和0.42～0.86之間，多態(tài)信息含量PIC在0.39～0.88之間；經(jīng)Bonferroni校正后，有3個位點(Scypa13、Scypa14和Scypa15)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.0028)，這可能是由于群體數(shù)量有限或者無效等位基因的存在造成的。經(jīng)MICRO-CHECKER軟件

5、計算，位點Scypa13、Scypa14和Scypa15的無效等位基因頻率分別為0.24、0.15和0.15；位點之間不存在連鎖不平衡。這一結(jié)果表明，18個標記均具有較高的多態(tài)信息含量，用于分析擬穴青蟹群體遺傳多樣性研究具有一定的可靠性和可信性。
　　 2、利用9對微衛(wèi)星引物對我國東南沿海擬穴青蟹11個地理群體397個個體進行了遺傳多樣性分析，9個位點在11個群體共檢測到104個等位基因，平均每個位點有11.6個等位基因，其中位

6、點Scypal的Na最少(6個)，位點Scypa8和Scpa03最多(16個)；Ne在2.5～11.8之間，平均每個位點5.3個；各個群體的平均HO和HE分別在0.62～0.771和0.66～0.76之間。對11個群體的分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，群體間的遺傳分化系數(shù)FST=0.0138，即總的遺傳變異中有1.38％的變異來自群體間，98.62％的變異來自群體內(nèi)。根據(jù)遺傳距離采用UPGMA法對11個群體進行聚類分析，深圳群體和漳

7、州群體間的遺傳距離最小(0.0121)，先聚合在一起，三門群體與其它群體間的遺傳距離較大?？偟膩碚f，各個群體均具有較高的遺傳多樣性，且平均雜合度呈現(xiàn)出自南向北逐漸降低的趨勢，而群體間的遺傳分化程度較低。這一結(jié)果為擬穴青蟹種質(zhì)資源的保護以及人工育種等工作提供了科學依據(jù)和資料支持。
　　 3、利用8個微衛(wèi)星標記對擬穴青蟹6個家系共275個個體進行了遺傳多樣性分析，共檢測到50個等位基因，平均每個位點4～8個，其中3個家系各自在1個位

8、點表現(xiàn)為單態(tài)，8個位點的PIC、HO和HE分別在0.40～0.77、0.33～0.81和0.42～0.80之間。對6個家系的AMOVA分析結(jié)果顯示，家系間的遺傳分化系數(shù)FST=0.2057，即總的遺傳變異中有20.57％的變異來自家系間，79.43％的變異來自家系內(nèi)。根據(jù)遺傳距離采用UPGMA法對6個家系進行聚類分析，4號家系和5號家系之間的遺傳距離最小，先聚合在一起，2號家系和6號家系間的遺傳距離最大.總的來說，各個家系的平均雜合度與