舌癌耐藥相關基因(TCRP1)在口腔鱗狀細胞癌順鉑化療及放療耐受中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的：口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma OSCC)是最常見的頭頸部腫瘤之一，化療仍然是口腔鱗癌尤其是進展期的口腔鱗癌患者的主要治療措施。順鉑(cDDP)是目前口腔鱗癌患者首選的化療藥物之一。然而，順鉑耐藥成為制約其臨床應用的主要障礙。TCRP1是我們前期實驗中，從舌癌耐藥細胞系 Tca8113/PYM中克隆出來的一個新基因，初步的功能研究發(fā)現在 Tca8113/PYM中沉默 TCRP1的表達后其順

2、鉑的敏感性明顯提高，相反在親本細胞中上調 TCRP1的表達則顯著提高其對順鉑的耐藥性。因而推測 TCRP1可能是一個順鉑耐藥相關基因。本研究將基于以上體外實驗結果，探討 TCRP1在口腔鱗癌組織中的表達及其與臨床順鉑耐藥的相關性；TCRP1在體內實驗中作用以及 TCRP1介導順鉑耐藥的機制。為進一步闡明口腔鱗癌耐藥機制，開發(fā)新的逆轉順鉑耐藥靶點提供理論依據。
　　 方法：
　　 (1)從病理標本庫中收集具備完整臨床資料的

3、口腔鱗癌標本，根據對順鉑化療的情況分為敏感組和不敏感組。將所篩選出來的標本制成組織芯片，通過免疫組化法檢測組織芯片中的’TCRP1的表達水平，然后對結果進行半定量積分法分析。統(tǒng)計分析 TCRP1的表達與性別、年齡、腫瘤分期、淋巴結轉移、化療效果及預后的關系。
　　 (2)無菌條件下收集新鮮口腔鱗癌組織，一部分組織制成單細胞懸液并種植于96孔板中，MTS法檢測其對順鉑藥物敏感性，另一部分進行固定、石蠟包埋并制成組織芯片，免疫組化檢

4、測這些組織中 TCRP1的表達，然后對結果進行半定量積分法分析，統(tǒng)計分析體外藥敏實驗結果與 TCRP1表達的相關性。
　　 (3)建立TCRP1高表達及沉默表達的口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型，分別隔日腹腔注射等體積的生理鹽水、順鉑(3mg/kg)和5-Fu(30mg/kg)，然后觀測腫瘤生長情況并繪制生長曲線。給藥16天后處死動物剝離腫瘤并固定石蠟包埋，制成組織芯片后免疫組化檢測TCRP1的表達，TUNEL檢測組織芯片細胞凋亡情況，分

5、析 TCRP1表達與裸鼠移植瘤的順鉑敏感性的關系。
　　 (4)為明確TCRP1在放療敏感性中的作用。利用前期建立的穩(wěn)定的。TCRP1過/沉默表達的細胞株，通過克隆形成實驗、MTT、彗星實驗及凋亡檢測分析上述細胞株及其對照細胞的放射敏感性。
　　 (5)HPLC法檢測cDDP在細胞內蓄積濃度變化，分析TCRP1對細胞內順鉑的吸收轉運的影響。Western Blotting檢測TCRP1過/沉默表達細胞株中Akt信號通路相

6、關分子的表達改變，包括Akt、p-Akt、bcl-2、NF-κB、金屬硫蛋白Ⅰ(MT-Ⅰ)。利用免疫共沉淀技術檢測可能與TCRP1發(fā)生相互作用的蛋白。
　　 (6)免疫組化法檢測口腔鱗癌及裸鼠移植瘤組織芯片中p-Akt、金屬硫蛋白(MT)的表達。
　　 結果：
　　 (1)舌癌組織芯片免疫組化的結果顯示：TCRP1表達主要定位于胞漿及胞核。在42例有完整臨床資料的舌癌標本中，有26例 TCRP1陰性或弱陽性表達，

7、16例陽性或強陽性表達。TCRP1的表達與各項臨床病理參數包括性別、年齡、TNM分期及有無淋巴結轉移均無顯著相關性。但是TCRP1與臨床療效有明顯相關，在 TCRP1表達(-)和(+)的患者中，緩解率達84.62％，而(++)和(+++)患者組中緩解率為37.5％。組間差異有顯著性(p=0.0301)。經Spearman相關分析顯示兩者呈正相關(p<0.05)。相關系數R=0.582。
　　 (2)MTS法檢測腫瘤組織體外藥物敏

8、感性，32例舌癌組織中共獲得27例有效數據，其中敏感18例，耐藥9例，敏感率66.6％，這與臨床順鉑敏感率基本一致。通過對 TCRP1免疫組化檢測，17例陰性(-)或弱陽性(+)，10例陽性(++)或強陽性(+++)。TCRP1(-)和(+)組對化療敏感者達94.2％，TCRP1(++)和(+++)組對化療敏感者為20.0％，兩組相比有顯著性差異(p<0.05)。提示TCRP1免疫組化檢測結果與體外藥敏實驗結果有相關性。
　　

9、(3)成功建立裸鼠移植瘤模型；相對于生理鹽水處理組，5-Fu組的裸鼠移植瘤在藥物作用下均表現明顯的生長抑制；cDDP組，TCRP1高表達的細胞組腫瘤生長仍然保持較快的生長速度，反之，TCRP1表達水平低的細胞組則表現較為明顯的生長抑制效應，提示 TCRP1的表達與裸鼠移植瘤的cDDP敏感性相關。TUNEL法檢測結果顯示，裸鼠移植瘤組織內凋亡細胞數隨TCRP1表達下調而明顯增加。
　　 (4)放療后克隆形成實驗結果顯示：過表達細胞

10、株Tca8113/TCRP1及對照細胞株的2Gy的生存分數(SF2)分別為0.69±0.04和0.35±0.05。Tca8113/PYM/siRNA及對照組的SF2分別為0.43±0.01和0.78±0.07，組間比較差異均有顯著性(p<0.05)。彗星實驗檢測4Gy的放射線照射后DNA損傷情況，放射線照射24小時后，與對照組相比，在TCRP1低表達的細胞株中，可見明顯的DNA拖尾現象。尾距明顯較高。Komet5.5 software軟

11、件分析圖形并統(tǒng)計學分析后顯示組間差異有顯著性(p<0.05)。Hoechst33258凋亡細胞染色發(fā)現4Gy的放射線照射后，TCRP1高表達的細胞株凋亡細胞數目明顯少于TCRP1表達下調的細胞株。同時，Western blot檢測舌癌細胞內凋亡相關蛋白的表達，結果顯示凋亡相關蛋白caspase-3，caspase-8及caspase-9基礎表達在TCRP1低表達細胞中明顯增高，相反，抗凋亡蛋白Bcl-2則在 TCRP1高表達細胞株中表達

12、升高。
　　 (5)HPLC法檢測結果顯示在不同的細胞株中，順鉑蓄積濃度沒有明顯差異。Western結果發(fā)現：Akt，p-Akt，NF-κB，MT-Ⅰ及抗凋亡蛋白bcl-2，隨TCRP1表達下調而下調。進一步的免疫共沉淀證實了TCRP1與Akt存在物理上的相互作用。Western證實 TCRP1對MT-Ⅰ可能存在正向調控作用。
　　 (6)免疫組化檢測口腔鱗癌組織芯片顯示：Akt及MT-Ⅰ的表達與TCRP1表達呈正相關。

13、
　　 結論：
　　 (1)TCRP1能預測口腔鱗癌對順鉑化療和放療的敏感性，可能是一個新的化、放療耐受標志物；
　　 (2)TCRP1可能通過增加口腔鱗癌對順鉑誘導的凋亡抗性而介導順鉑耐受；
　　 (3)TCRP1介導OSCC對放療耐受作用可能與增加放射線誘導的DNA損傷修復有關。
　　 (4)TCRP1主要定位于胞核和胞漿，TCRP1不改變細胞內順鉑的蓄積濃度，其作用與“藥泵”功能無關；