PGRN在宮頸癌細(xì)胞順鉑化療耐受中的作用機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，盡管已有人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)疫苗等預(yù)防措施，但仍然嚴(yán)重威脅著女性健康，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，在14～44歲女性中的致死率僅次于乳腺癌。宮頸癌的致病因素有多種，其中高危型的HPV病毒感染是導(dǎo)致宮頸癌形成的主要因素。HPV的病毒癌基因E6及E7影響到細(xì)胞內(nèi)周期蛋白的表達(dá)及功能，比如:E6基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠降解抑癌蛋白p53從而抑制其作用的發(fā)揮;E7基因能夠降解抑癌

2、蛋白pRb，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。雖然近年已有針對(duì)HPV病毒疫苗，但疫苗具有一定的局限性，僅針對(duì)于少數(shù)特定的HPV病毒型，并且對(duì)于宮頸癌患者及HPV攜帶者沒有有效的作用。臨床治療宮頸癌的主要手段仍然依賴于傳統(tǒng)的手術(shù)、放射治療與藥物化療。其中化療通常作為宮頸癌治療的常用輔助手段，配合手術(shù)治療、放療。
　　鉑類藥物是常用的化療藥物，如順鉑，卡鉑，奧沙利鉑等。順鉑是典型的鉑類藥物之一，在結(jié)構(gòu)上，它由一個(gè)二價(jià)鉑與兩個(gè)氯原子及兩個(gè)氨分子構(gòu)成，分

3、子質(zhì)量為301.1。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)歷一系列水合作用，一個(gè)或兩個(gè)氯原子被水分子取代，成為有活性的形式。活化的順鉑是一類具有高度活性的分子，可以結(jié)合DNA、RNA、蛋白質(zhì)和膜磷脂等，其中順鉑與DNA形成鏈內(nèi)及鏈間的加合物，從而阻斷DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過程，使細(xì)胞周期阻斷從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是順鉑介導(dǎo)細(xì)胞毒性的主要機(jī)制。
　　盡管化療是癌癥患者主要的治療手段，然而在化療過程中，癌細(xì)胞可通過獲得性或固有性方式產(chǎn)生針對(duì)各種抗腫瘤藥物的耐藥性，

4、即多藥耐藥。多藥耐藥往往導(dǎo)致化療失敗，是導(dǎo)致腫瘤患者復(fù)發(fā)和死亡的突出臨床問題。多藥耐藥的具體機(jī)制十分復(fù)雜，其中最重要的機(jī)制是可利用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為能量驅(qū)動(dòng)多種抗癌藥物外排的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette(ABC) transporters)高表達(dá)。多藥耐藥蛋白(MRP)亞家族是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的C組，又稱ABCC，其中MRP2、MRP5及MRP6與細(xì)胞

5、的鉑類藥物耐藥有關(guān)。
　　PGRN（progranulin，前體顆粒蛋白），是由7.5個(gè)串聯(lián)重復(fù)的富含半胱氨酸的GRN基序組成，參與多種生物學(xué)功能。現(xiàn)已證實(shí)PGRN與炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、軟骨發(fā)育、早期胚胎發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病及腫瘤形成有關(guān)。有研究報(bào)道PGRN能夠保護(hù)細(xì)胞抵抗順鉑導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，但未對(duì)具體的機(jī)制做深入的研究，且僅在肝癌細(xì)胞系誘導(dǎo)的順鉑耐受細(xì)胞株中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)PGRN在宮頸癌組織中高表達(dá)，PGR

6、N能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與增殖。然而，PGRN在宮頸癌化療藥物應(yīng)答中的作用及PGRN促進(jìn)順鉑化療耐受的分子機(jī)制還有待深入研究。
　　目的:本論文旨在表征PGRN在順鉑處理的宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)變化;明確PGRN在順鉑化療耐受中的功能，探索PGRN促進(jìn)化療耐受的機(jī)制及關(guān)鍵的調(diào)控通路。
　　方祛:利用順鉑處理宮頸癌細(xì)胞系（HeLa、SiHa及CaSki）檢測(cè)PGRN的mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)變化;通過加入重組PGRN或抑制細(xì)胞

7、內(nèi)PGRN表達(dá)，使用CCK8、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)順鉑處理的宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞活力、細(xì)胞死亡與凋亡、DNA損傷等的影響;利用ICP-MS技術(shù)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)外鉑元素的含量;使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡法分析PGRN處理的宮頸癌細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP2和轉(zhuǎn)錄因子NRF2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:順鉑能夠劑量和時(shí)間依賴性地促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞系中PGRN的表達(dá)，PGRN能夠緩解順鉑對(duì)細(xì)胞造成的細(xì)胞活力阻滯，抵抗順鉑造成的細(xì)胞死亡及DNA

8、損傷，PGRN能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的外排作用，減少細(xì)胞內(nèi)的藥物積累;PGRN能夠通過NRF2提高細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥蛋白MRP2的表達(dá)水平，參與PGRN介導(dǎo)的順鉑外排及順鉑耐受。
　　結(jié)論:本論文首次發(fā)現(xiàn)PGRN能夠抵抗順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞死亡，促進(jìn)癌細(xì)胞的生存發(fā)展;首次證實(shí)了PGRN能夠通過轉(zhuǎn)錄因子NRF2促進(jìn)MRP2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低宮頸癌細(xì)胞內(nèi)順鉑藥物的積累增加藥物的外排，介導(dǎo)順鉑耐受。這些研究進(jìn)一步完善了PGRN對(duì)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的