毛冠鹿睪丸組織cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及PRM1基因的研究.pdf

1、為構(gòu)建毛冠鹿睪丸組織cDNA文庫(kù)，用TRIzol試劑提取總RNA，利用SMART(switchingmechanism at 5'end of RNA transcript)技術(shù)合成cDNA第一鏈，雙鏈cDNA經(jīng)LD-PCRfLong-distance PCR)擴(kuò)增并經(jīng)sfi I酶切和過柱分級(jí)分離后，克隆入經(jīng)sfi I酶切的λTriplEX2載體，經(jīng)體外包裝而成cDNA原始文庫(kù)。該毛冠鹿睪丸組織cDNA原始文庫(kù)含有獨(dú)立克隆數(shù)度為1.01

2、 kb。通過隨機(jī)挑取噬菌斑，并克隆測(cè)序，從該文庫(kù)中克隆了毛冠鹿睪丸組織表達(dá)基因：Pl精蛋白基因(PRMl)(GellBank序列號(hào)：DQ299383)，該cDNA具有5’和3’非編碼區(qū)，從第95至250個(gè)核苷酸為一完整閱讀框(ORF)，此閱讀框編碼一個(gè)51 Aa的P1精蛋白。結(jié)果顯示本文構(gòu)建的毛冠鹿睪丸組織cDNA文庫(kù)符合建庫(kù)要求，可作為進(jìn)一步克隆毛冠鹿睪丸組織特異表達(dá)基因的可靠材料。 提取毛冠鹿基因組DNA，用EcoR I、

3、EcoR V和Pst I酶切毛冠鹿基因組DNA。將酶切后的基因DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。用PCR法標(biāo)記PRMl 基因地高辛(DIG)探針，進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果顯示，經(jīng)EcoR I酶切的基因組DNA和探針雜交后雌雄結(jié)果無(wú)差異。3種限制性內(nèi)切酶消化并雜交后，都產(chǎn)生了2條帶，而且限制酶切圖譜表明該基因內(nèi)部(包括內(nèi)含子)無(wú)此3種內(nèi)切酶位點(diǎn)。以上結(jié)果表明PRMl 基因在毛冠鹿基因組DNA中存在兩種形式的拷貝。 以毛冠鹿腦、肌肉、心臟

4、、肺、睪丸、腎、肝和脾的總RNA為模板，合成cDNA第一鏈。用毛冠鹿P1精蛋白基因特異引物RT-PCR分析了不同組織PRMl表達(dá)狀況。為保證模板用量的一致，以毛冠鹿β<,2>-微球蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明PRMl基因僅在睪丸組織中表達(dá)，而其他組織不表達(dá)。 由于PRMl基因具有高度進(jìn)化速率，使得它們成為一個(gè)很有效的系統(tǒng)進(jìn)化分子標(biāo)記。根據(jù)毛冠鹿PRMl cDNA序列設(shè)計(jì)引物。從毛冠鹿、小麂、赤麂、黑麂和獐