海馬齒全長cDNA文庫構(gòu)建及耐鹽相關(guān)基因的克隆.pdf

1、海馬齒主要分布于熱帶和亞熱帶海岸的沙灘上,國內(nèi)外學(xué)者研究證實海馬齒具有良好的鹽環(huán)境適應(yīng)性,且在海水和淡水環(huán)境中均能良好生長,是一種研究植物耐鹽和克隆耐鹽相關(guān)基因的理想材料。本研究構(gòu)建了海馬齒全長cDNA文庫,并采用最新發(fā)展的Solexa測序技術(shù),對鹽脅迫和非鹽脅迫條件下生長的海馬齒,進(jìn)行高通量的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析,獲得差異表達(dá)的tag序列,然后從cDNA文庫中分離差異全長基因。
　　 本研究構(gòu)建的鹽脅迫下海馬齒的全長cDNA文庫

2、:用改良CTAB法提取總RNA,SMART法反轉(zhuǎn)錄成cDNA,LD-PCR方法合成雙鏈cDNA。LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化和sfi1酶切后,經(jīng)CHROMA SPIN+TE-1000分離柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照適當(dāng)?shù)谋壤B接λTripIEx2載體。連接產(chǎn)物利用MaxPlaxTM LambdaPackaging Extracts進(jìn)行體外包裝,得到海馬齒初級cDNA文庫。初始文庫的獨(dú)立克隆數(shù)為2.4×106

3、pfu,初級文庫滴度大于4.80×106 pfu/mL,重組率為93.75％,插入片段在0.5-5 kb之間,擴(kuò)增文庫的滴度為1.21×109pfu/mL,所得文庫質(zhì)量較高。
　　 經(jīng)Solexa高通量測序技術(shù),獲得了鹽脅迫和非鹽脅迫條件下海馬齒的差異表達(dá)的tag序列,其中淡水和海水處理的海馬齒轉(zhuǎn)錄組中,分別分析了763911和2073628個16bp長的序列,獲得了海水處理苗的轉(zhuǎn)錄組中993662個標(biāo)簽,淡水處理苗的轉(zhuǎn)錄組中4

4、50349個標(biāo)簽,海水處理苗種特異表達(dá)的標(biāo)簽有158921,淡水處理苗中特異表達(dá)的標(biāo)簽有3038個,并得到226個在兩轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)量有顯著差異的標(biāo)簽。
　　 依據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析得到的標(biāo)簽子以及已發(fā)表的耐鹽基因的序列信息,本研究在全長cDNA文庫中克隆得到了甜菜堿脫氫酶基因BADH,該BADH基因共有1503個堿基,可編碼500個氨基酸,編碼的多肽理論分子量為54.53 kDa,理論等電點為pI:5.22,海馬齒BADH基因與千穗谷、