鼠疫疫苗引起的小鼠記憶B細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化及其分子發(fā)育機(jī)制研究.pdf

1、鼠疫是一種傳播快、發(fā)病急、傳染性極強(qiáng)且病死率極高的自然疫源性烈性傳染病。鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis,以下簡稱鼠疫菌)是其病原體。據(jù)記載,在人類歷史上,世界范圍內(nèi)曾爆發(fā)過3次鼠疫大流行,并致使至少一億六千萬人死亡?，F(xiàn)如今,鼠疫在全球重新進(jìn)入了一個(gè)活躍期,同時(shí)其自然疫源地也在逐步擴(kuò)增,人間鼠疫不斷發(fā)生。而在2000年,世界衛(wèi)生組織將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。鼠疫菌本由o:1b血清型假結(jié)核耶爾森菌進(jìn)化而來的。其廣泛存在于我們

2、的生活環(huán)境中,并可經(jīng)過水或食物進(jìn)行傳播從而引發(fā)非致死性的腸道疾病。而在自然界中,嚙齒類和蚤類作為傳播媒介傳播鼠疫菌,使宿主可引發(fā)全身系統(tǒng)性感染的致死性疾病。另外,抗生素治療鼠疫雖然效果良好,但敗血癥型鼠疫與肺型鼠疫進(jìn)展十分迅速,即使早期足量合理使用抗生素,病死率依然較高,且治療鼠疫的抗生素副作用較大。而近年來世界各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)耐藥鼠疫菌菌株。因此,研究鼠疫疫苗具有重要意義。
　　傳統(tǒng)鼠疫疫苗中滅活全菌疫苗保護(hù)時(shí)間短,而且僅對(duì)腺鼠疫有

3、效,已被淘汰;減毒活疫苗對(duì)腺鼠疫和肺鼠疫均具有良好的保護(hù)活性,但副作用嚴(yán)重,目前已在許多西方國家停止使用。重組亞單位疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫苗的許多缺陷,不含有感染性組分,無致病性,而且具有在體內(nèi)不復(fù)制的優(yōu)點(diǎn),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)腺鼠疫和肺鼠疫均具有良好的免疫保護(hù)作用,因此亞單位疫苗成為當(dāng)前鼠疫疫苗研究的熱點(diǎn)。
　　目前鼠疫亞單位疫苗的研究大多是基于F1莢膜抗原和V抗原。為了研制一種安全、高效的鼠疫亞單位疫苗,我們從鼠疫菌疫苗株中提取純化了

4、高純度天然F1抗原,同時(shí)避開V抗原產(chǎn)生免疫抑制作用的區(qū)段,克隆表達(dá)了不帶任何標(biāo)簽和載體序列的部分V抗原(rV270抗原)。將rV270抗原和天然F1抗原分別吸附到人可用的鋁佐劑中制備了鼠疫亞單位疫苗,并經(jīng)小鼠、豚鼠、兔和獼猴動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明具有良好的免疫保護(hù)作用和安全性。我們在研究中發(fā)現(xiàn),亞單位疫苗和EV76減毒活疫苗免疫的小鼠雖然維持較高的F1抗體滴度長達(dá)518天,但分別在免疫后56天、136天和518天三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)攻毒時(shí)均未發(fā)現(xiàn)F1抗

5、體滴度有明顯升高的現(xiàn)象,這個(gè)結(jié)果顯然不符合記憶B細(xì)胞遇到相同抗原時(shí)快速、大量產(chǎn)生抗體的一般結(jié)論。眾所周知,維持長久體液免疫反應(yīng)有兩種方式:
　　第一,長壽命漿細(xì)胞通過不斷產(chǎn)生抗體維持機(jī)體的體液免疫反應(yīng);
　　第二,記憶B細(xì)胞不斷分化出短壽命漿細(xì)胞,然后通過短壽命漿細(xì)胞分泌抗體維持體液免疫反應(yīng)。因而通過鼠疫疫苗免疫小鼠后了解是否有記憶B細(xì)胞產(chǎn)生、記憶B細(xì)胞產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化以及記憶B細(xì)胞分化發(fā)育的分子機(jī)制,進(jìn)而為新型鼠疫疫苗的設(shè)計(jì)

6、和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　我們通過采用皮下注射人免疫劑量1/10的EV76減毒活疫苗和20μg/只劑量的F1亞單位疫苗免疫6-7周齡雌性Balb/c小鼠,分別在免疫后的八個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲取小鼠脾臟細(xì)胞及骨髓細(xì)胞,用特異性抗體—CD19,CD27,CD38,IgD進(jìn)行細(xì)胞表面抗體標(biāo)記。通過流式細(xì)胞儀的篩選,分析記憶B細(xì)胞及漿細(xì)胞的含量變化。同時(shí),建立四個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)空白組,分別為EV76(1/5)組、EV76(1/10×2)組、EV76(

7、1/10)+F1亞單位疫苗組、F1亞單位疫苗+EV76(1/10)組及空白組,通過多次免疫后,采用酶聯(lián)免疫法檢測小鼠抗體滴度的變化。而后進(jìn)一步通過流式細(xì)胞分離技術(shù)分離小鼠的B淋巴細(xì)胞,即幼稚B細(xì)胞,記憶B細(xì)胞及漿細(xì)胞三種細(xì)胞,采用Trizol法提取這三種細(xì)胞的總RNA。最終采用RNA-seq技術(shù)測定小鼠的幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞的總RNA表達(dá)譜,進(jìn)而進(jìn)行表達(dá)譜的比較。
　　通過本實(shí)驗(yàn)證明EV76減毒活疫苗及F1亞單位疫苗免疫

8、小鼠后,無論在脾臟細(xì)胞及骨髓細(xì)胞均有記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生,并存在先上升后下降的變化趨勢,在免疫后7天,記憶B細(xì)胞及漿細(xì)胞開始產(chǎn)生,脾臟細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中的記憶B細(xì)胞含量分別在免疫第42天和第56天時(shí)達(dá)到高峰,漿細(xì)胞含量在免疫第56天時(shí)達(dá)到高峰,而免疫第77時(shí),記憶B細(xì)胞的總含量逐漸下降,直至免疫第98天記憶B細(xì)胞的含量已接近正常小鼠,漿細(xì)胞則在免疫第77天有所下降并維持一定水平。結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,都具有顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酶聯(lián)免疫法

9、檢測抗體滴度與記憶B細(xì)胞數(shù)量變化趨勢大體一致,均在在第56天達(dá)到高峰,而后維持穩(wěn)定的抗體滴度在一定水平上,且初次免疫EV76減毒活疫苗,而加強(qiáng)免疫F1亞單位疫苗的實(shí)驗(yàn)組其抗體滴度明顯高于兩次免疫EV76減毒活疫苗組的抗體滴度。總RNA測序?qū)⒂洃汢細(xì)胞與幼稚B細(xì)胞,漿細(xì)胞與幼稚B細(xì)胞,記憶B細(xì)胞與漿細(xì)胞進(jìn)行比較。記憶B細(xì)胞與幼稚B細(xì)胞組共比對(duì)15765個(gè)基因,其中高表達(dá)基因697個(gè),低表達(dá)基因820個(gè),與細(xì)胞或免疫相關(guān)的基因共有131個(gè);

10、漿細(xì)胞與幼稚B細(xì)胞共比對(duì)16304個(gè)基因,其中高表達(dá)基因1574個(gè),低表達(dá)基因451個(gè),其中與細(xì)胞或免疫相關(guān)的基因有162個(gè),記憶B細(xì)胞與漿細(xì)胞共比對(duì)16212個(gè)基因,其中高表達(dá)基因1495個(gè),低表達(dá)基因252個(gè),其中與細(xì)胞或免疫相關(guān)的基因有164個(gè)。
　　依據(jù)研究結(jié)果表明：
　　①在免疫早期記憶B細(xì)胞在脾臟細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中均無產(chǎn)生,脾臟細(xì)胞中的記憶B細(xì)胞逐漸增多直至免疫第42天達(dá)到高峰,而骨髓中的記憶B細(xì)胞則在免疫第56天

11、達(dá)到峰值,隨后,脾臟細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中的記憶B細(xì)胞的含量急劇下降,表明鼠疫疫苗免疫小鼠雖有產(chǎn)生但維持時(shí)間較短;另一方面,漿細(xì)胞在脾臟細(xì)胞中數(shù)量變化趨勢雖與骨髓細(xì)胞中的數(shù)量變化趨勢基本一致,但在總體數(shù)量上比較,漿細(xì)胞在脾臟細(xì)胞中的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于骨髓細(xì)胞中的含量,這就說明漿細(xì)胞主要存在于脾臟細(xì)胞中。綜上所述,我們推測小鼠在免疫后可以長期維持較高的抗體滴度是由于長壽命漿細(xì)胞的作用。
　?、谝罁?jù)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)結(jié)果,我們可以得出,小鼠首次接受較

12、少量抗原免疫后,當(dāng)再次接觸較大劑量的抗原免疫時(shí),會(huì)產(chǎn)生明顯升高的抗體滴度的變化。因此可得知,抗體滴度的變化不僅與記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān),而且同時(shí)很有可能與小鼠體內(nèi)的抗原—抗體數(shù)量比例也有著密切聯(lián)系。
　?、弁ㄟ^RNA-Seq技術(shù)對(duì)B淋巴細(xì)胞的三種亞群即幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞的全基因組測序比對(duì)基因可以得出,與補(bǔ)體受體、免疫球蛋白家族、淋巴細(xì)胞抗原和細(xì)胞因子類等相關(guān)的基因在幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞及漿細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn),但這些基因在這