TLR4信號調(diào)節(jié)小鼠B淋巴細(xì)胞發(fā)育的實驗研究.pdf

1、目的：B淋巴細(xì)胞起源于多能造血干細(xì)胞，在整個發(fā)育過程當(dāng)中經(jīng)歷了多個發(fā)育階段，造血干細(xì)胞必須成功經(jīng)過各個發(fā)育階段后，才能成為一個正常發(fā)揮免疫應(yīng)答功能的成熟B淋巴細(xì)胞。但是B細(xì)胞發(fā)育的精確調(diào)控機(jī)制可能會因許多病理條件而被擾亂，特別值得關(guān)注的是炎癥的影響。Toll樣受體是一種能夠識別多種病原相關(guān)分子的蛋白，一旦識別病原相關(guān)分子之后，它們可以啟動一系列反應(yīng)激活免疫系統(tǒng)清除入侵病原微生物，從而構(gòu)成機(jī)體免疫的第一道防線；TLR誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，

2、而許多這類因子對B細(xì)胞發(fā)育均有抑制作用。這兩個原本獨立的現(xiàn)象提示TLR信號與B細(xì)胞發(fā)育間存在某種關(guān)聯(lián)?？紤]到TLR信號對成熟B細(xì)胞功能具有直接而深刻的影響，一個顯而易見的問題是TLR信號是否對發(fā)育中的B細(xì)胞也有類似的直接作用。在本試驗中，我們檢測了TLR4在各個階段B細(xì)胞中的表達(dá)水平，檢測了正常C3H/He小鼠和C3H/HeJ小鼠之間B細(xì)胞分布的區(qū)別，同時通過體內(nèi)和體外試驗檢測了TLR4信號對發(fā)育中的B細(xì)胞的影響。
　　方法：通過

3、實時熒光定量PCR檢測TLR4在各個B細(xì)胞亞群中的表達(dá)水平；對C57BL/6小鼠腹膜內(nèi)注射LPS，在不同時間點取骨髓通過細(xì)胞計數(shù)及流式檢測B細(xì)胞及各個亞群的變化；流式細(xì)胞儀分析正常C3H/He小鼠和C3H/HeJ小鼠骨髓內(nèi)全B細(xì)胞以及B細(xì)胞亞群的比例；FACs分選出的未成熟B細(xì)胞體外培養(yǎng)，LPS處理后通過CFSE染色檢測增殖代數(shù)，通過流式檢測培養(yǎng)細(xì)胞表面IgD、CD21、CD23、CD86的表達(dá)；FACs分選出的未成熟B細(xì)胞體外培養(yǎng)，分

4、別用LPS、anti-μ或者LPS+anti-μ處理之后，流式檢測細(xì)胞分化和凋亡的相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：（1）實時熒光定量PCR結(jié)果顯示小鼠骨髓中四個B細(xì)胞亞群均表達(dá)TLR4，并且matureB細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于前三個亞群，而脾來源的matureB細(xì)胞的表達(dá)水平又明顯高于骨髓來源的matureB細(xì)胞；（2）對C57BL/6小鼠應(yīng)用LPS處理后，發(fā)現(xiàn)處理后的小鼠骨髓細(xì)胞總數(shù)、全B細(xì)胞、preB細(xì)胞和immatureB細(xì)胞計數(shù)在第

5、1周會明顯下降，隨后會出現(xiàn)反彈性的異常增高，在第3周的時候逐漸恢復(fù)正常水平；（3）在C3H/HeJ小鼠骨髓中，全B細(xì)胞、proB、preB細(xì)胞占總骨髓細(xì)胞的比例均明顯高于正常的C3H/He小鼠，而immatureB和matureB細(xì)胞的比例沒有統(tǒng)計學(xué)意義的差別；（4）ImmatureB細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中應(yīng)用LPS刺激后，IgD、CD21、CD23、CD86的陽性率均明顯高于陰性對照組；（5）ImmatureB細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中應(yīng)用LPS

6、、anti-μ或者LPS+anti-μ刺激后，發(fā)現(xiàn)LPS+anti-μ組的凋亡細(xì)胞比例明顯低于anti-μ組，而其IgD陽性率則明顯低于LPS組。
　　結(jié)論：（1）TLR4的表達(dá)水平在新生B淋巴細(xì)胞遷出骨髓后會有一個大幅度的提高，這種提高可能是受到外周環(huán)境當(dāng)中的微生物組分和各種細(xì)胞因子的影響；（2）當(dāng)小鼠體內(nèi)TLR4信號過強(qiáng)時，骨髓內(nèi)的B淋巴細(xì)胞也會出現(xiàn)異常發(fā)育，至于這種異常是由于早期造血干細(xì)胞向淋系的發(fā)育受阻還是由于B淋巴細(xì)胞的

7、發(fā)育加速，經(jīng)過我們的分析，這兩種原因可能在這一過程中都起著一定的作用；（3）在TLR4功能缺失的小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育是異常的，主要是阻滯在proB、preB和immatureB細(xì)胞三個早期的階段；（4）TLR4信號可以使immatureB細(xì)胞向成熟方向分化，并可以幫助自身免疫性B淋巴細(xì)胞逃避陰性選擇過程免于凋亡；（5）LPS促進(jìn)immatureB細(xì)胞分化成熟這一作用可以被anti-μ抑制掉。以上試驗結(jié)果提示TLR4信號在體內(nèi)外均可促