異丙酚影響新生大鼠學(xué)習(xí)記憶發(fā)育及其細(xì)胞毒性機(jī)制研究.pdf

1、在過去的20年中，大量的文獻(xiàn)報(bào)道吸入麻醉藥、咪唑安定、異丙酚、苯妥因鈉、氯胺酮等藥物在腦以及心臟缺血再灌注損傷、Ca2+超載時(shí)均可發(fā)揮保護(hù)作用。然而，在近幾年來，JohnWOlney、VesnaJevtovic-Todorovic等陸續(xù)報(bào)道了氯胺酮、笑氣、咪唑安定、異氟醚可誘發(fā)新生大鼠多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象、導(dǎo)致新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)育異常。臨床資料也顯示，兒童在接受抗癲癇病藥物治療后可影響學(xué)習(xí)記憶功能的發(fā)育；癲癇病孕婦接受苯妥因鈉等

2、藥物治療后，可導(dǎo)致子代智商低下。 從神經(jīng)保護(hù)到神經(jīng)毒性，人們對麻醉劑作用的認(rèn)識存在巨大的分歧，鎮(zhèn)靜藥、抗癲癇藥物、全麻藥物具有神經(jīng)保護(hù)作用還是神經(jīng)毒性作用?其誘發(fā)新生神經(jīng)元凋亡的機(jī)制又是什么? 異丙酚，分子結(jié)構(gòu)中含有苯酚。雖然這種含酚類結(jié)構(gòu)的藥物在臨床麻醉中得到廣泛的應(yīng)用，而且未顯示出其神經(jīng)毒性作用，但對處于生長發(fā)育中的嬰幼兒，其潛在的危害不容忽視。然而臨床上不斷有人將異丙酚用于3歲以下的嬰幼兒。大量的臨床研究顯示這種用

3、法似乎是安全的。 異丙酚具有誘導(dǎo)迅速，蘇醒快捷而安全，持續(xù)輸注后無蓄積等優(yōu)點(diǎn)，因而普遍用于麻醉誘導(dǎo)與維持、局部麻醉中的輔助鎮(zhèn)靜、ICU鎮(zhèn)靜等，是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常用的靜脈麻醉藥物。但異丙酚潛在的神經(jīng)毒性尚未定論，且有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道甚少，很有必要就此問題進(jìn)行進(jìn)一步研究，以得出明確的結(jié)論。 鑒于此，本研究旨在探討異丙酚是否存在神經(jīng)毒性，以及其細(xì)胞毒性的可能機(jī)理。本研究分為3個(gè)部分進(jìn)行：1.從整體動(dòng)物行為學(xué)的角度，利用Morris

4、水迷宮系統(tǒng)，研究不同劑量、不同麻醉時(shí)間的異丙酚對新生大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；2.從原代細(xì)胞的角度，通過以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為細(xì)胞模型，研究不同劑量、不同麻醉時(shí)間的異丙酚對大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的影響，并探討其作用機(jī)制；3.從可傳代的神經(jīng)細(xì)胞株的角度，通過與神經(jīng)系細(xì)胞生理特性類似的PC12細(xì)胞為細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討異丙酚誘發(fā)細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)理。 第一章異丙酚對新生大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)育的影響 本實(shí)驗(yàn)從

5、整體動(dòng)物行為學(xué)的角度，利用Morris水迷宮系統(tǒng)進(jìn)行檢測，研究不同劑量的異丙酚對新生大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)育的影響。 方法：5窩新生第7天SD大鼠，按照隨機(jī)區(qū)組化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每窩內(nèi)新生大鼠隨機(jī)分為對照組、三種不同劑量異丙酚組。三種不同劑量異丙酚組分別皮下注射異丙酚10mg/kg、50mg/kg、50mg/kg兩次。大鼠出生后28天開始行Morris水迷宮測試。整個(gè)測試過程持續(xù)9天。Morris水迷宮測試程序包括可視平臺試驗(yàn)、定位航

6、行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)三部分?？梢暺脚_試驗(yàn)持續(xù)4天，每天4次測試，每次120秒?？梢暺脚_試驗(yàn)之后，大鼠休息2天后進(jìn)行為期5天的定位航行試驗(yàn)以及空間探索試驗(yàn)。記錄大鼠尋找平臺的潛伏期、路徑長度和游泳速度、穿環(huán)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間。 結(jié)果：在可視平臺試驗(yàn)中第1天時(shí)，與Con組比較，P10組大鼠尋找可視平臺的潛伏期縮短；與Con組比較，P50D、P50組潛伏期的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在4天過程中，與Con組比較，P50D、P50組的平均潛

7、伏期延長，P10組與Con組的平均潛伏期的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 在定位航行試驗(yàn)中，與Con組比較，P50D組每天的潛伏期均延長；與Con組比較，P50組數(shù)量上雖有所延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Con組比較，P10組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與P50組比較，P50D組每天的潛伏期均延長。 在空間探索試驗(yàn)中，與Con組比較，P50D組大鼠潛伏期延長，大鼠穿環(huán)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間均減少；與Con組比較，P50組穿環(huán)次數(shù)、目標(biāo)象限停留

8、時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Con組比較，P10組穿環(huán)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.亞麻醉劑量異丙酚持續(xù)作用于新生第7天大鼠4h，可抑制大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的發(fā)育，導(dǎo)致其在Morris水迷宮試驗(yàn)中的行為學(xué)測試成績低于對照組大鼠。 2.亞麻醉劑量異丙酚作用于新生第7天大鼠2h，不足以抑制大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶功能的發(fā)育，但可導(dǎo)致其在Morris水迷宮可視平臺試驗(yàn)中學(xué)習(xí)能力下降，經(jīng)過訓(xùn)練后與對照組

9、大鼠的成績比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.鎮(zhèn)靜劑量異丙酚作用于新生第7天大鼠1h，可導(dǎo)致其在Morris水迷宮可視平臺試驗(yàn)中短期內(nèi)學(xué)習(xí)能力提高，但后期的成績與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第二章異丙酚對離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元生長發(fā)育的影響 本研究擬評價(jià)不同濃度異丙酚對胎鼠離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元生長發(fā)育的影響。 方法：體外培養(yǎng)妊娠18d的SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元。分3部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每部分均將分離后的神經(jīng)元隨機(jī)分為分5組：空白對照

10、組、20％脂肪乳組和3個(gè)不同濃度異丙酚組。第1部分：P2組、P4組、和P8組分別加入終濃度為2、4、8μg/ml的異丙酚，E1組加入20％脂肪乳，測定6d后測定神經(jīng)元樹突總長度、初級突起數(shù)和分支突起數(shù)；第2部分：P5組、P10組和P20組分別加入終濃度為5、10、20μg/ml的異丙酚，E2組加入20％脂肪乳，作用24h后再孵育2、4、6、8d后進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)，并計(jì)算神經(jīng)元生存率；第3部分：P5組、P10組和P50組分別加入5、10、5

11、0μg/ml異丙酚，E3組給予20％脂肪乳，作用24h后計(jì)數(shù)凋亡神經(jīng)元數(shù)目和神經(jīng)元總數(shù)，計(jì)算神經(jīng)元凋亡率。 結(jié)果：與C1組比較，E1組神經(jīng)元樹突總長度、初級突起數(shù)和分支突起數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P4組、P8組中，異丙酚作用4h后神經(jīng)元樹突總長度、初級突起數(shù)和分支突起數(shù)均降低；P2組、P4組、P8組中，異丙酚作用8h后神經(jīng)元樹突總長度、初級突起數(shù)和分支突起數(shù)均降低。P2組、P4組、P8組中各組內(nèi)比較，異丙酚作用8h后神經(jīng)元樹突總長

12、度、初級突起數(shù)和分支突起數(shù)均降低。與C2組比較，P10組孵育第6天和第8天神經(jīng)元存活數(shù)目減少，P20組孵育第4天、第6天和第8天神經(jīng)元存活數(shù)目減少，其余各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與C3組比較，E3組細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P5組、P10組和P50組神經(jīng)元凋亡率升高；與P5組比較，P10組和P50組神經(jīng)元凋亡率升高。 結(jié)論： 1.異丙酚可抑制大鼠海馬神經(jīng)元樹突生長發(fā)育，并呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性； 2.高濃度

13、異丙酚則可抑制大鼠海馬神經(jīng)元存活，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。 第三章異丙酚對神經(jīng)元樣嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株的毒性作用及其機(jī)理 通過與神經(jīng)系細(xì)胞生理特性類似的PC12細(xì)胞為細(xì)胞模型，探討異丙酚誘發(fā)細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)理。 方法：以體外培養(yǎng)的經(jīng)神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)分化2天的未成熟神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。將PC12細(xì)胞隨機(jī)分成空白對照組、P1、P5、P10、P25、P50、P7各濃度異丙酚處理組，異丙酚處理組分別加入終末濃度

14、為1、5、10、25、50、75μg/ml的異丙酚。以四唑鹽比色法檢測各處理組PC12細(xì)胞的活性；用Hoechst33342染色法，熒光顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞的凋亡情況；結(jié)合原位末端標(biāo)記技術(shù)和PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況；Westernblotting法檢測PC12細(xì)胞Caspase-3、P-akt蛋白、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Bax表達(dá)的變化。 結(jié)果：異丙酚作用48h后，以Hoechst33342染色法染色，在熒光

15、顯微鏡下觀察，對照組細(xì)胞核著色均勻，未見凋亡細(xì)胞；P25組細(xì)胞可見少量藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)的凋亡細(xì)胞核，成碎裂狀；P50組中可見致密濃染凋亡細(xì)胞明顯增多；P75組中可見大量致密濃染，碎裂狀的凋亡細(xì)胞核。 異丙酚作用48小時(shí)后，對照組只有極少量的TUNEL陽性細(xì)胞；與對照組比較，低濃度組P25無明顯差異；中高濃度組的凋亡比例明顯增加。 異丙酚作用48h后，運(yùn)用PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞凋亡率，進(jìn)行定量比較。對照組凋亡率

16、低，與對照組比較，隨著異丙酚濃度的增加，PC12的凋亡比例逐漸增加。 異丙酚作用48h后，對照組僅有少量caspase-3的表達(dá)，而異丙酚P75組caspase-3的表達(dá)明顯增多。 不同濃度異丙酚作用于PC12細(xì)胞，處理2小時(shí)后對PC12細(xì)胞的P-Akt表達(dá)水平進(jìn)行檢測。異丙酚P75組組內(nèi)比較，異丙酚作用10min即開始抑制作用Akt的活化，2h時(shí)即可見P-Akt的表達(dá)明顯下降，明顯低于空白對照組。 不同濃度異丙

17、酚作用于24小時(shí)后，對PC12細(xì)胞的Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值水平進(jìn)行檢測，隨著異丙酚濃度的增加，Bax逐漸升高。與對照組比較，P25組、P50組、P75組Bcl-2/Bax均明顯降低。 結(jié)論： 1.低濃度異丙酚即可抑制PC12細(xì)胞活性，高濃度異丙酚可誘發(fā)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，異丙酚對PC12細(xì)胞的毒性作用呈現(xiàn)濃度依賴性。 2.高濃度異丙酚可以激活PC12細(xì)胞caspase-3，抑制Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Bax