苦參堿、積雪草苷對人肺成纖維細(xì)胞干預(yù)作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 本研究旨在利用中藥苦參堿及積雪草苷作用于人肺成纖維細(xì)胞，通過研究對炎癥及非炎癥刺激后成纖維細(xì)胞的增殖及基因表達(dá)的變化來評價苦參堿及積雪草苷對氣道重塑的作用，并探討其作用機(jī)制，為苦參堿及積雪草苷在COPD氣道重塑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞用于實驗。不同濃度的苦參堿(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mmol/L)及積雪草苷(6.25、12.

2、5、25、50、100、200、400ug/ml)作用于細(xì)胞，運用CCK-8法測定細(xì)胞增殖受抑制情況，繪制細(xì)胞生長曲線；RealtimePCR法檢測血管緊張素Ⅱ10-7mol/L誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞加入苦參堿0.8mmol/L及積雪草苷400ug/ml干預(yù)24小時后TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原等mRNA的表達(dá)情況，以及2％O2刺激24小時后人肺成纖維細(xì)胞加入苦參堿0.8mmol/L及積雪草苷400ug/ml干預(yù)后HIF-1α及VEG

3、FmRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)苦參堿、積雪草苷對成纖維細(xì)胞增殖的影響（CCK-8方法）：
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度苦參堿孵育細(xì)胞24小時后檢測OD值：正常對照組為0.81±0.06，濃度0.1mmol/L時為0.83±0.12，0.2mmol/L時0.76±0.13，0.4mmol/L時0.85±0.06，此三個濃度下的OD值與正常組相比均無顯著意義(P＞0.05)；濃度為0.8mmol/L

4、時OD值0.21±0.08，1.6mmol/L時0.14±0.08,3.2mmol/L時0.13±0.07，6.4mmol/L時0.12±0.03，以上各濃度對細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度積雪草苷孵育細(xì)胞24小時后檢測OD值：正常對照組為0.82±0.07，濃度6.25ug/ml時為0.73±0.07，12.5ug/ml時0.74±0.12，25ug/ml時0.7

5、9±0.08,50ug/ml時0.82±0.11，100ug/ml時0.75±0.03，200ug/ml時0.79±0.05，200ug/ml以下的藥物濃度對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；濃度達(dá)到400ug/ml時，OD值為0.59±0.03，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)成纖維細(xì)胞中TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原等mRNA的表達(dá)情況：
　　 通過Realt

6、imePCR方法測定，以正常對照組的TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)1.00±0.00為標(biāo)準(zhǔn)；
　　 1)血管緊張素Ⅱ的作用：加入血管緊張素Ⅱ10-7mol/L誘導(dǎo)24小時后，TGF-β1mRNA為206.37±129.83，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CTGF為21.92±7.58，有顯著差異(P＜0.01)；Ⅰ型膠原為至368.64±192.78，有顯著差異(P＜0.01)；
　　 2)苦

7、參堿的作用：在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，加入苦參堿0.8mmol/L共同孵育細(xì)胞24小時后，TGF-β1mRNA表達(dá)為1.86±0.10，與血管緊張素Ⅱ刺激組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CTGF為0.0014±0.00071，有顯著差異(P＜0.01)；Ⅰ型膠原為0.46±0.36，有顯著差異(P＜0.01)；
　　 3)積雪草苷的作用：在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，加入積雪草苷400ug/ml共同孵育細(xì)胞24小時后，TGF

8、-β1mRNA表達(dá)為2.31±1.39，與血管緊張素Ⅱ刺激組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CTGF為0.0017±0.00163，有顯著差異(P＜0.01)；I型膠原為0.51±0.32，有顯著差異(P＜0.01)。
　　 (3)成纖維細(xì)胞HIF-1α及VEGFmRNA的表達(dá)情況：
　　 通過RealtimePCR方法測定，以正常對照組的HIF-1α及VEGFmRNA的表達(dá)1.00±0.00為標(biāo)準(zhǔn)：
　　 1

9、)低氧的作用：以2%O2誘導(dǎo)24小時后，HIF-1αmRNA表達(dá)為19.50±11.54，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);VEGF為157.46±112.30，有顯著差異(P＜0.01)；
　　 2)苦參堿的作用：在2%O2誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，加入苦參堿0.8mmol/L作用24小時后，HIF-1αmRNA表達(dá)為0.78±0.74，與低氧刺激組相比有顯著差異(P＜0.01);VEGF為5.53±5.89，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0

10、.05)；
　　 3)積雪草苷的作用：在2%O2誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，加入積雪草苷400ug/m作用24小時后，HIF-1αmRNA表達(dá)為0.14±0.08，與低氧刺激組相比有顯著差異(P＜0.01);VEGF為3.56±3.42，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；
　　 結(jié)論：
　　 (1)正常情況下人肺成纖維細(xì)胞中TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原HIF-1α及VEGF均有少量表達(dá)。
　　 (2)AngⅡ刺激人肺成

11、纖維細(xì)胞后，細(xì)胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)增強(qiáng)，說明AngⅡ?qū)GF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原的表達(dá)有上調(diào)作用，是人肺成纖維細(xì)胞增殖過程中重要的誘導(dǎo)劑。
　　 (3)經(jīng)低氧刺激后，人肺成纖維細(xì)胞HIF-1α及VEGFmRNA的表達(dá)上調(diào)，表明低氧對人肺成纖維細(xì)胞有刺激作用。
　　 (4)苦參堿一定濃度范圍對人肺成纖維細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原m

12、RNA的表達(dá)及低氧刺激后細(xì)胞HIF-1α及VEGFmRNA的表達(dá)有抑制作用，提示苦參堿可能對氣道重塑的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。
　　 (5)積雪草苷低劑量各濃度組對人肺成纖維細(xì)胞的增殖均無明顯抑制作用，其原因可能是由于積雪草苷具有較低的細(xì)胞毒性；但積雪草苷對細(xì)胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原基因的表達(dá)以及低氧情況下細(xì)胞HIF-1α及VEGF的表達(dá)有明顯的抑制作用，說明其能夠抑制成纖維細(xì)胞增生、活化過程中各種炎性因子的表達(dá)，從而可能