苦參堿、積雪草苷對人肺成纖維細胞干預作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 本研究旨在利用中藥苦參堿及積雪草苷作用于人肺成纖維細胞，通過研究對炎癥及非炎癥刺激后成纖維細胞的增殖及基因表達的變化來評價苦參堿及積雪草苷對氣道重塑的作用，并探討其作用機制，為苦參堿及積雪草苷在COPD氣道重塑的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人肺成纖維細胞用于實驗。不同濃度的苦參堿(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mmol/L)及積雪草苷(6.25、12.

2、5、25、50、100、200、400ug/ml)作用于細胞，運用CCK-8法測定細胞增殖受抑制情況，繪制細胞生長曲線；RealtimePCR法檢測血管緊張素Ⅱ10-7mol/L誘導的人肺成纖維細胞加入苦參堿0.8mmol/L及積雪草苷400ug/ml干預24小時后TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原等mRNA的表達情況，以及2％O2刺激24小時后人肺成纖維細胞加入苦參堿0.8mmol/L及積雪草苷400ug/ml干預后HIF-1α及VEG

3、FmRNA的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)苦參堿、積雪草苷對成纖維細胞增殖的影響（CCK-8方法）：
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度苦參堿孵育細胞24小時后檢測OD值：正常對照組為0.81±0.06，濃度0.1mmol/L時為0.83±0.12，0.2mmol/L時0.76±0.13，0.4mmol/L時0.85±0.06，此三個濃度下的OD值與正常組相比均無顯著意義(P＞0.05)；濃度為0.8mmol/L

4、時OD值0.21±0.08，1.6mmol/L時0.14±0.08,3.2mmol/L時0.13±0.07，6.4mmol/L時0.12±0.03，以上各濃度對細胞增殖的抑制作用明顯，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度積雪草苷孵育細胞24小時后檢測OD值：正常對照組為0.82±0.07，濃度6.25ug/ml時為0.73±0.07，12.5ug/ml時0.74±0.12，25ug/ml時0.7

5、9±0.08,50ug/ml時0.82±0.11，100ug/ml時0.75±0.03，200ug/ml時0.79±0.05，200ug/ml以下的藥物濃度對細胞增殖無明顯抑制作用，與對照組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；濃度達到400ug/ml時，OD值為0.59±0.03，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (2)成纖維細胞中TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原等mRNA的表達情況：
　　 通過Realt

6、imePCR方法測定，以正常對照組的TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原的mRNA表達1.00±0.00為標準；
　　 1)血管緊張素Ⅱ的作用：加入血管緊張素Ⅱ10-7mol/L誘導24小時后，TGF-β1mRNA為206.37±129.83，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);CTGF為21.92±7.58，有顯著差異(P＜0.01)；Ⅰ型膠原為至368.64±192.78，有顯著差異(P＜0.01)；
　　 2)苦

7、參堿的作用：在血管緊張素Ⅱ誘導的基礎(chǔ)上，加入苦參堿0.8mmol/L共同孵育細胞24小時后，TGF-β1mRNA表達為1.86±0.10，與血管緊張素Ⅱ刺激組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);CTGF為0.0014±0.00071，有顯著差異(P＜0.01)；Ⅰ型膠原為0.46±0.36，有顯著差異(P＜0.01)；
　　 3)積雪草苷的作用：在血管緊張素Ⅱ誘導的基礎(chǔ)上，加入積雪草苷400ug/ml共同孵育細胞24小時后，TGF

8、-β1mRNA表達為2.31±1.39，與血管緊張素Ⅱ刺激組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);CTGF為0.0017±0.00163，有顯著差異(P＜0.01)；I型膠原為0.51±0.32，有顯著差異(P＜0.01)。
　　 (3)成纖維細胞HIF-1α及VEGFmRNA的表達情況：
　　 通過RealtimePCR方法測定，以正常對照組的HIF-1α及VEGFmRNA的表達1.00±0.00為標準：
　　 1

9、)低氧的作用：以2%O2誘導24小時后，HIF-1αmRNA表達為19.50±11.54，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);VEGF為157.46±112.30，有顯著差異(P＜0.01)；
　　 2)苦參堿的作用：在2%O2誘導的基礎(chǔ)上，加入苦參堿0.8mmol/L作用24小時后，HIF-1αmRNA表達為0.78±0.74，與低氧刺激組相比有顯著差異(P＜0.01);VEGF為5.53±5.89，有統(tǒng)計學意義(P＜0

10、.05)；
　　 3)積雪草苷的作用：在2%O2誘導的基礎(chǔ)上，加入積雪草苷400ug/m作用24小時后，HIF-1αmRNA表達為0.14±0.08，與低氧刺激組相比有顯著差異(P＜0.01);VEGF為3.56±3.42，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；
　　 結(jié)論：
　　 (1)正常情況下人肺成纖維細胞中TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原HIF-1α及VEGF均有少量表達。
　　 (2)AngⅡ刺激人肺成

11、纖維細胞后，細胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原的mRNA表達增強，說明AngⅡ?qū)GF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原的表達有上調(diào)作用，是人肺成纖維細胞增殖過程中重要的誘導劑。
　　 (3)經(jīng)低氧刺激后，人肺成纖維細胞HIF-1α及VEGFmRNA的表達上調(diào)，表明低氧對人肺成纖維細胞有刺激作用。
　　 (4)苦參堿一定濃度范圍對人肺成纖維細胞的增殖有明顯的抑制作用，且對血管緊張素Ⅱ誘導的細胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原m

12、RNA的表達及低氧刺激后細胞HIF-1α及VEGFmRNA的表達有抑制作用，提示苦參堿可能對氣道重塑的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。
　　 (5)積雪草苷低劑量各濃度組對人肺成纖維細胞的增殖均無明顯抑制作用，其原因可能是由于積雪草苷具有較低的細胞毒性；但積雪草苷對細胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型膠原基因的表達以及低氧情況下細胞HIF-1α及VEGF的表達有明顯的抑制作用，說明其能夠抑制成纖維細胞增生、活化過程中各種炎性因子的表達，從而可能