積雪草苷對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖以及膠原與TGF-β1mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 瘢痕，是創(chuàng)傷后機(jī)體修復(fù)的必然結(jié)果，它不僅影響美觀而且還會(huì)導(dǎo)致組織和器官不同程度的功能障礙。但是創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包含各種修復(fù)細(xì)胞和細(xì)胞因子等眾多因素共同參與的細(xì)胞化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)過(guò)程。因此，如何減少瘢痕的形成，防治病理性瘢痕的增生與發(fā)展，一直也是皮膚科的棘手問(wèn)題。一般認(rèn)為瘢痕的形成機(jī)制主要是由修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子及這三者之間的相互作用關(guān)系所組成，防治瘢痕的作用機(jī)理的研究也是圍繞著

2、這三方面進(jìn)行開展的。本研究通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的方法探討中藥積雪草苷對(duì)培養(yǎng)的原代瘢痕組織成纖維細(xì)胞形態(tài)影響，以及對(duì)細(xì)胞增殖活性與自分泌Ⅰ、Ⅲ膠原和TGF-β1mRNA的抑制作用，旨在為積雪草苷在皮膚科臨床應(yīng)用上提供一些理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1原代細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下，將手術(shù)切除的瘢痕組織放入含有青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中漂洗，采用組織塊法培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定成功后，取3-10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

3、
　　 2細(xì)胞形態(tài)觀察將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕成纖維細(xì)胞以20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整成2×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，200μL/孔，24小時(shí)后細(xì)胞貼壁，設(shè)置空白對(duì)照組，分別加入不同濃度藥物在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察積雪草苷對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞(FB)形態(tài)變化的影響。
　　 3.MTT測(cè)定細(xì)胞增殖觀察細(xì)胞形態(tài)后，每孔加入5mg/mL MTT20μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去液

4、體，加入DMSO150μL/孔，震蕩10min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在492nm處的吸光度值(OD值)，檢測(cè)不同濃度積雪草苷對(duì)瘢痕FB增殖的抑制作用。
　　 4.RT-PCR測(cè)細(xì)胞mRNA將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合后，實(shí)驗(yàn)組加入低、高濃度的藥液，培養(yǎng)24h后，取5×106個(gè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，提取RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA的合成，合成后cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)積雪草苷對(duì)瘢痕FB自分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β

5、1mRNA的影響。
　　 5.采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，組間計(jì)數(shù)資料用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 與對(duì)照組相比，積雪草苷藥物濃度在0.1-1.0 mg/mL范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組中瘢痕成纖維細(xì)胞體積縮小、變短，樹突狀突起回縮，細(xì)胞間隙變大，并且這種作用隨著藥物濃度的增加越明顯；積雪草苷濃度在0.1-1.0 mg/mL范圍內(nèi)，瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，且增殖的抑制效應(yīng)