積雪草苷和羥基積雪草苷抗心肌缺血及缺血再灌注損傷作用和機(jī)制研究.pdf

1、中藥積雪草是傘形科植物積雪草[Centella asiatica(L.)Urban]的干燥全草，為各版《中國(guó)藥典》收藏品種，主要含有三萜皂苷類成分，被認(rèn)為是一種具有治療各種熱癥、癰疽、瘰疬等功效的藥物。積雪草苷(asiaticoside，AC)及羥基積雪草苷(madecassoside，MC)是積雪草三萜皂苷類的主要成分。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過(guò)體外藥物篩選實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)AC和MC這兩種化合物可有效保護(hù)大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，同時(shí)

2、具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，通過(guò)離體動(dòng)脈條實(shí)驗(yàn)還證明積雪草苷類化合物具有擴(kuò)張小動(dòng)脈的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AC和MC化合物可能具心血管活性。 本研究利用離體、整體動(dòng)物急性心肌缺血及心肌缺血再灌注損傷(myocardialischemia reperfusion injury,MIRI)模型，以心功能、血清酶活性、心肌梗塞面積等為指標(biāo)，深入研究AC及MC對(duì)心肌缺血預(yù)防和治療作用，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的藥物作用特點(diǎn)進(jìn)一步研究其在細(xì)胞、分子水

3、平的作用機(jī)制。 1.積雪草苷抗心肌缺血活性及其可能機(jī)制 制備大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，AC預(yù)處理后，記錄不同時(shí)間點(diǎn)冠脈流量和心肌收縮力，用定量組織化學(xué)染色方法計(jì)算心肌梗死面積；預(yù)先給予AC，制備急性心肌缺血病理模型，計(jì)算心肌梗死面積，檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)，、超氧化物岐化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量；在預(yù)防給藥情況下，制備在體兔心肌缺血再灌注損傷模型

4、，采用生理多導(dǎo)儀檢測(cè)心率(HR)、血壓(BP)、心功能等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，檢測(cè)血清中LDH、CK活性，ELISA法測(cè)定血清中C反應(yīng)蛋白(CRP)含量，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果顯示AC可明顯減小左心及全心心肌梗死面積，具有劑量依賴性，能明顯改善心功能，作用特點(diǎn)在于對(duì)血壓和心率無(wú)影響。 在進(jìn)行相關(guān)機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，AC可降低心肌缺血所致的MDA含量升高程度，升高SOD活性，具有清除血清中氧自由基作用；AC可降低心肌缺血再灌

5、注損傷所致的CRP升高程度，可能具有抗炎活性，從而降低心肌缺血損傷程度；AC可明顯減少心肌細(xì)胞凋亡，可能具有抗凋亡活性。 2．羥基積雪草苷抗心肌缺血再灌注損傷活性及其可能機(jī)制 制備大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，MC預(yù)處理后，記錄不同時(shí)間點(diǎn)冠脈流量和心肌收縮力，用定量組織化學(xué)染色方法計(jì)算心肌梗死面積；制備兔心肌缺血再灌注損傷(MIRI)模型，缺血前靜脈滴注MC，多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)心電圖、血流動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)，用定量組織化學(xué)染色方法

6、計(jì)算心肌梗死面積，檢測(cè)血清中酶活性及MDA含量，ELISA法測(cè)定血清中C反應(yīng)蛋白(CRP)含量，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，SP法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BCl-2表達(dá)；在此模型基礎(chǔ)上，改變給藥時(shí)間窗，再灌注時(shí)靜脈滴注MC，多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)心電圖、血流動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)，用定量組織化學(xué)染色方法計(jì)算心肌梗死面積，檢測(cè)血清中酶活性及MDA含量，考察MC對(duì)缺血再灌注損傷的治療作用；制備大鼠缺血再灌注所致心率失常模型，采用生理多導(dǎo)儀記錄心電圖，記錄首次心率

7、失常發(fā)生的時(shí)間及再灌注至心電圖恢復(fù)正常所持續(xù)時(shí)間；制備原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，預(yù)先給予MC，采用熒光探針?lè)z測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度、活性氧(ROS)水平，采用熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量。 研究結(jié)果顯示MC在藥效學(xué)上可明顯減小左心及全心心肌梗死面積，具有一定量效關(guān)系；對(duì)相關(guān)的血清酶學(xué)指標(biāo)和心電圖有一定的改善作用；并能明顯改善心功能，降低平均動(dòng)脈壓，且對(duì)心率無(wú)影響；再灌注時(shí)給予MC，明顯抑制血清中CK和L

8、DH的升高，改善心功能，且作用時(shí)間長(zhǎng)于維拉帕米、作用強(qiáng)度優(yōu)于香丹注射液，對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定的治療作用；MC能明顯縮短再灌后心電圖異常持續(xù)時(shí)間，且在一定劑量上能明顯延遲首次發(fā)生時(shí)間，對(duì)缺血再灌注所致心律失常具有一定的抑制作用。 機(jī)制研究表明，MC可降低血清：MDA含量，升高SOD活性，能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，可降低原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所致胞內(nèi)ROS升高水平，證明MC具有抗氧化活性，減輕自由基損傷；MC可降低血清中CRP升高